一種銀耳膠原蛋白肽的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明公開了一種銀耳膠原蛋白肽的提取方法，屬于膠原蛋白肽制備技術領域。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是一種高分子蛋白質，絲狀的膠原蛋白纖維，能使皮膚保持結實而有彈性。膠原蛋白具有很強的生物活性和生物功能，能參與細胞的迀移、分化和增殖，使骨骼、肌腱、軟骨和皮膚具有一定的機械強度。膠原蛋白肽是膠原蛋白在一定的化學作用或酶的作用下發生“水解”反應后得到的分子量在1000dalton以下的產物。膠原蛋白肽具有獨特的生理活性，它不僅有蛋白質的營養特性，消化吸收率可達100%，而且有保護胃粘膜、抗潰瘍、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降膽固醇、增強骨強度、預防骨質疏松、預防關節炎、促進傷口愈合、促進角膜上皮細胞的修復和生長、促進皮膚膠原代謝、免疫調節等多種生理功能。
[0003]近年來，膠原蛋白肽已廣泛應用于生物、醫療、食品、化妝品等諸多領域。膠原蛋白肽的用范圍也日趨廣泛，其需求量正逐年增長。以往提取膠原蛋白肽的原料它們主要來源于畜禽動物組織，但由于宗教和習俗等原因，有些地區不能使用。再加上近年來，由于瘋牛病和口蹄疫的影響，人們已經開始轉向從魚類中提取膠原蛋白肽，因為其所提取的膠原蛋白肽更為安全。
[0004]目前膠原蛋白肽的制備主要方法有:高溫高壓蒸煮法、酸法、酶法、酸法和酶法相全士么云口口 ο
[0005](I)高壓蒸煮法能夠快速提取膠原蛋白肽，然而該工藝的高壓在生產中易引發安全問題，制備的樣品分子量分布廣，均勻度較差；
(2)酶法提取是目前用得較多的方法，根據膠原蛋白的結構特點選擇合適當的酶提取；但該工藝制備的產品分子量較集中，產品附加值較高，但由于魚鱗除了膠原蛋白外還含有大量的無機鹽、脂肪等雜質，這些雜質影響酶的酶活，使得酶提取膠原蛋白肽的產率太低，難以滿足產業化大規模生產；
(3)酸法提取雖降低成本，但單一的酸法提取得到的產品分子量分布廣，均勻度差；
(4)酸法與酶法結合提取可以提高產率，制備產品的分子量較集中，但產率仍然很低，造成浪費。
[0006]上述的傳統方法存在以下問題:
①工藝復雜:這些方法都需要經歷除雜蛋白、去除脂肪，提取膠原蛋白再酶解膠原蛋白得到膠原蛋白肽這幾個程序，工藝復雜；
②污染環境:為了去除皮上的雜蛋白和脂肪，需要加入化學試劑，帶來了環境污染的問題；
③成本高:以上這些方法，程序多工藝復雜，生產成本高，再加上需要加入昂貴的蛋白酶，進一步增加了生產成本。
【發明內容】
[0007]本發明主要解決的技術問題:針對目前傳統方法在提取膠原蛋白肽的過程中，原料主要源于畜禽動物組織，由于瘋牛病和口蹄疫的影響，原料對于人體危害較大，且在制備過程中程序工藝復雜，需要加入化學試劑，帶來了環境污染的問題，另外還需要加入昂貴的蛋白酶，增加了生產成本的現狀，提供了一種以淀粉和磁性粉末制得固定化蛋白酶，將銀耳作為原材料，經預處理后酶解，干燥，從而得到銀耳膠原蛋白肽。該方法工藝簡便，原料易得，在制備過程中避免了漂白劑、氧化劑等化學試劑，對環境無任何污染問題，利用固定化蛋白酶代替游離蛋白酶，使用后可以回收，降低了生產成本，使得最終制得的蛋白酶產率高達90 %以上、純度高達95 %以上，適合大規模應用。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:
(1)稱取30?40g可溶性淀粉溶于300?400mL去離子水中，裝入帶有攪拌器和溫度計的IL三口燒瓶中，再加入I?2mL濃度為0.2mol/L氯化亞鐵溶液和2?3mL質量濃度為30%雙氧水，啟動攪拌器以300?400r/min轉速進行攪拌；
(2)在攪拌過程中滴加35?45mL濃度為lmol/L的燒堿溶液，控制滴加速度使其20?30min內滴加完畢，再將三口燒瓶移入油浴鍋，加熱升溫至100?110°C，保持油浴溫度不變，繼續攪拌反應3?4h后放入溫度為4?6°C冰水浴中，靜置沉淀10?12h后過濾得到濾渣，干燥后得到磁性淀粉微球；
(3)稱取5?1g木瓜蛋白酶和3?5g堿性蛋白酶加入400?500mL磷酸緩沖液中，放置在超聲振蕩儀中，以100?200W功率超聲振蕩25?35min后，加入20?30g上述制得的磁性淀粉微球，繼續振蕩8?10h，將反應液用臥式離心機以8000?9000r/min的轉速離心10?15min，分離去除上清液，得到固定化蛋白酶，備用；
(4)稱取400?500g干銀耳放入40?50°C的溫水中浸泡I?2h，待其充分溶脹后，用蒸餾水將其表面污物清洗干凈，用剪刀將洗凈后的銀耳剪成I cm X I cm的小塊，分別用I?2L濃度為0.2mol/L燒堿和I?2L無水乙醇浸泡I?2天，最后用去離子水沖洗5?7遍，得到預處理后的銀耳；
(5)將300?400g上述預處理后的銀耳裝入高壓反應釜中，按料液比為1:2向釜內加入去離子水，升高釜內溫度至100?200°C并提高壓力至0.2?0.3MPa，保溫保壓處理30?40min后出料；
(6)將上述物料移入酶解罐，加入物料總質量I?2%的備用的固定化蛋白酶，用保鮮膜密封罐口后放入恒溫箱中，升溫至40?50°C，保溫酶解6?Sh后，在酶解罐周圍施加勻強磁場，分離回收磁性固定化蛋白酶，再將酶解液用孔徑為0.4?0.5μπι的納濾膜進行過濾，得到大分子膠原蛋白肽濾液，經噴霧干燥后研磨過100目標準篩，即可得到銀耳膠原蛋白肽粉末。
[0009]本發明的應用方法是:使用時，取2?5g本發明制得的銀耳膠原蛋白肽粉末放入50?10mL化妝品乳液中，充分混合均勻，在每日早晚潔面后，取3?5mL混合液涂抹在臉上各個部位，輕輕拍打使得完全吸收為止，長期使用，不僅可修復皮膚斷裂老化的彈力纖維網，使皮膚彈性揮發，柔韌充盈，而且還可消除體內自由基，多途徑抗氧化，減緩皮膚衰老。
[0010]本發明的有益效果是: (1)本發明方法獨特新穎，原料簡單易得，在制備過程中避免了漂白劑、氧化劑等化學試劑，對環境無任何污染問題；
(2)本發明在制備的過程中利用固定化蛋白酶代替游離蛋白酶，降低了生產成本；
(3)本發明制得的銀耳膠原蛋白肽粉末無色無味，分子量為1200?3200D，可廣泛應用于保健食品、生物醫藥、化妝品等與人體健康相關的行業。
【具體實施方式】
[0011]首先稱取30?40g可溶性淀粉溶于300?400mL去離子水中，裝入帶有攪拌器和溫度計的IL三口燒瓶中，再加入I?2mL濃度為0.2mol/L氯化亞鐵溶液和2?3mL質量濃度為30%雙氧水，啟動攪拌器以300?400r/min轉速進行攪拌;然后在攪拌過程中滴加35?45mL濃度為lmol/L的燒堿溶液，控制滴加速度使其20?30min內滴加完畢，再將三口燒瓶移入油浴鍋，加熱升溫至100?110°C，保持油浴溫度不變，繼續攪拌反應3?4h后放入溫度為4?61冰水浴中，靜置沉淀10?12h后過濾得到濾渣，干燥后得到磁性淀粉微球；隨后稱取5?1g木瓜蛋白酶和3?5g堿性蛋白酶加入400?500mL磷酸緩沖液中，放置在超聲振蕩儀中，以100?200W功率超聲振蕩25?35min后，加入20?30g上述制得的磁性淀粉微球，繼續振蕩8?10h，將反應液用臥式離心機以8000?9000r/min的轉速離心10?15min，分離去除上清液，得到固定化蛋白酶，備用;接下來稱取400?500g干銀耳放入40?50°C的溫水中浸泡I?2h，待其充分溶脹后，用蒸餾水將其表面污物清洗干凈，用剪刀將洗凈后的銀耳剪成IcmXI cm的小塊，分別用I?2L濃度為0.2mol/L燒堿和I?2L無水乙醇浸泡I?2天，最后用去離子水沖洗5?7遍，得到預處理后的銀耳;之后將300?400g上述預處理后的銀耳裝入高壓反應釜中，按料液比為1:2向釜內加入去離子水，升高釜內溫度至100?200°C并提高壓力至0.2?0.3MPa，保溫保壓處理30?40min后出料;最后將上述物料移入酶解罐，加入物料總質量I?2%的備用的固定化蛋白酶，用保鮮膜密封罐口后放入恒溫箱中，升溫至40?50°C，保溫酶解6?8h后，在酶解罐周圍施加勻強磁場，分離回收磁性固定化蛋白酶，再將酶解液用孔徑為0.4?0.5μπι的納濾膜進行過濾，得到大分子膠原蛋白肽濾液，經噴霧干燥后研磨過100目標準篩，即可得到銀耳膠原蛋白肽粉末。
[0012]實例I
首先稱取30g可溶性淀粉溶于300mL去離子水中，裝入帶有攪拌器和溫度計的IL三口燒瓶中，再加入ImL濃度為0.2mol/L氯化亞鐵溶液和2mL質量濃度為30%雙氧水，啟動攪拌器以300r/min轉速進行攪拌;然后在攪拌過程中滴加35mL濃度為lmol/L的燒堿溶液，控制滴加速度使其20min內滴加完畢，再將三口燒瓶移入油浴鍋，加熱升溫至100°C，保持油浴溫度不變，繼續攪拌反應3h后放入溫度為4°C冰水浴中，靜置沉淀1h后過濾得到濾渣，干燥后得到磁性淀粉微球;隨后稱取5g木瓜蛋