具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種肝細(xì)胞培養(yǎng)基,尤其涉及一種具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基及其 應(yīng)用,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì),也是 培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。市售一般為化學(xué)成分明確的試劑配制的合成培養(yǎng)基,主 要可以分為兩類,一類是液體培養(yǎng)基;另一類是干粉培養(yǎng)基,目前常用于科研的培養(yǎng)基主要 是無(wú)菌液體培養(yǎng)基,RPMI 1640液體培養(yǎng)基是其中的一種,其起初用于懸浮培養(yǎng)和單層培養(yǎng) 人白血病細(xì)胞,現(xiàn)適用于大量哺乳動(dòng)物細(xì)胞,包括此1^、1虹1?^、10^7、?(:12、?81(:、星形膠 質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞等。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展,對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)基的專業(yè)性要求越來(lái)越 高,因此,需要在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加一些特定物質(zhì)。
[0003] L-02細(xì)胞也是可以用RPMI 1640液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的一種永生化肝細(xì)胞系,這 種細(xì)胞系具有良好的肝功能和較強(qiáng)體外增殖能力,并且沒(méi)有致瘤性,是一種優(yōu)異的人胎肝 細(xì)胞源。同時(shí)L-02細(xì)胞可以大量的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng),用于細(xì)胞治療技術(shù)研究和科研醫(yī)療中,具有 很高的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 但是L-02細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)代謝產(chǎn)生大量氨,氨的存在會(huì)妨礙細(xì)胞的生長(zhǎng),損 害細(xì)胞功能,進(jìn)一步會(huì)影響L-02細(xì)胞在科研和醫(yī)療上的使用。因此,研制出一種能持續(xù)降氨 的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)目前L-02細(xì)胞的培養(yǎng)以及使用來(lái)說(shuō)是十分必要的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明目的在于克服L-02細(xì)胞在現(xiàn)有技術(shù)條件下培養(yǎng)容易產(chǎn)生大量氨,影響細(xì)胞 生長(zhǎng)的不足,提供一種具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用,解決了 L-02細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò) 程中產(chǎn)生大量氨的問(wèn)題,得到了能夠持續(xù)降氨的細(xì)胞培養(yǎng)基,同時(shí)還能夠增強(qiáng)L-02細(xì)胞的 活力與功能。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所提供的具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基,該肝細(xì)胞培養(yǎng) 基以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,含有10%胎牛血清,還含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、L-鳥(niǎo)氨 酸-α-酮戊二酸、胰島素。
[0007] 優(yōu)選地,所述肝細(xì)胞培養(yǎng)基中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的含量為10~2〇yg/L、L-鳥(niǎo)氨酸-α-酮戊二酸的含量為1~5mM、胰島素的含量為0.5~1.0U/L。
[0008] 優(yōu)選地,所述肝細(xì)胞培養(yǎng)基中還含有5~12g/L的谷氨酸鹽,所述谷氨酸鹽為谷氨 酸鈉和/或谷氨酸鉀。
[0009] 優(yōu)選地,所述肝細(xì)胞培養(yǎng)基中還含有0.5~1. Og/L的精氨酸。
[0010]進(jìn)一步優(yōu)選地,所述肝細(xì)胞培養(yǎng)基中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的含量為13~16yg/L、L-鳥(niǎo) 氨酸-α-酮戊二酸的含量為2~3mM、谷氨酸鈉的含量為7~12g/L、精氨酸的含量為0.53~ 0.75g/L〇
[0011]進(jìn)一步優(yōu)選地,所述肝細(xì)胞培養(yǎng)基中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的含量為17~19yg/L、L-鳥(niǎo) 氨酸-α-酮戊二酸的含量為2~3.5mM、谷氨酸鉀的含量為5~8g/L、精氨酸的含量為0.75~ 0.85g/L〇
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選地,所述肝細(xì)胞培養(yǎng)基中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的含量為15~18yg/L、L-鳥(niǎo) 氨酸-α-酮戊二酸的含量為3.7~4.5mM、谷氨酸鈉的含量為8.3~10.2g/L、谷氨酸鉀的含量 為1.5~1.8g/L、精氨酸的含量為0.8~0.9g/L。
[0013] 更進(jìn)一步優(yōu)選地,所述肝細(xì)胞培養(yǎng)基還含有抗氧化劑,為還原型谷胱甘肽和/或維 生素 C,其在培養(yǎng)基中的含量為10~50mg/L。
[0014] 上述方案中,所述肝細(xì)胞為L(zhǎng)-02細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明還提供了一種利用上述肝細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法,每50ml所述肝細(xì) 胞培養(yǎng)基接種的肝細(xì)胞數(shù)量小于或等于2.2 X107,培養(yǎng)條件為5%⑶2,37°C,每24小時(shí)更換 培養(yǎng)基,48小時(shí)后,細(xì)胞鋪滿率為80~90%。
[0016] 本發(fā)明采用了多種促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)的組分,其中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一種多功能細(xì) 胞因子,具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和運(yùn)動(dòng)的作用。L-鳥(niǎo)氨酸-α-酮戊二酸為鳥(niǎo)氨酸和α-酮戊二酸的 混合物,鳥(niǎo)氨酸可與精氨酸和谷氨酸等相互轉(zhuǎn)變,酮戊二酸是谷氨酸脫氨基的酮酸產(chǎn)物, 能夠通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用生成谷氨酸,因此其在一定程度上能夠降低氨的濃度,生成的谷氨酸 又可與氨結(jié)合成無(wú)毒的谷氨酰胺,實(shí)現(xiàn)再次降氨。同上,谷氨酸鈉、谷氨酸鉀能夠與氨結(jié)合, 且精氨酸與谷氨酸鈉、谷氨酸鉀合用可加強(qiáng)降氨療效。添加胰島素的培養(yǎng)基會(huì)影響細(xì)胞的 脂質(zhì)代謝,滿足細(xì)胞增殖的需要,調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。該培養(yǎng)基中的抗氧化劑是一種天然的水 溶性抗氧化劑,如維生素 C或還原型谷胱甘肽,它能通過(guò)淬滅自由基活性,保護(hù)肝細(xì)胞膜,抑 制細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到進(jìn)一步提高L-02細(xì)胞規(guī)?;囵B(yǎng)的密度和功能狀態(tài)。
[0017] 本發(fā)明的有益效果:解決了L-02細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量氨的問(wèn)題,降低了L-02細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的產(chǎn)氨量,同時(shí)該培養(yǎng)基可調(diào)節(jié)該細(xì)胞的增殖與功能。此外該培養(yǎng)基 制備方法簡(jiǎn)單,原料易得。在上述內(nèi)容的基礎(chǔ)上,本發(fā)明所述肝細(xì)胞培養(yǎng)基不僅可以滿足L-02細(xì)胞的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),同時(shí)還能有效降低L-02細(xì)胞的產(chǎn)氨量,促進(jìn)L-02細(xì)胞的分裂 等,從而提高L-02細(xì)胞產(chǎn)量,并改善其功能。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0019] 制備以下實(shí)施例中涉及的肝細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí),僅需按照相應(yīng)比例稱取原料,混合均 勻即得。
[0020] 采用本發(fā)明具有降氨能力的肝細(xì)胞時(shí),每50ml培養(yǎng)基接種的肝細(xì)胞數(shù)量應(yīng)小于或 等于2.2 X 107,培養(yǎng)條件為5 % C02,37°C的培養(yǎng)箱,每24小時(shí)更換培養(yǎng)基,48小時(shí)后,細(xì)胞鋪 滿率為80~90 %。
[0021] 實(shí)施例1
[0022]具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基1,以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,它含有10% 胎牛血清,還含有15yg/L肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子,ImM的L-鳥(niǎo)氨酸-α-酮戊二酸、1.0U/L胰島素。 [0023] 實(shí)施例2
[0024]具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基2,以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,它含有10% 胎牛血清,還含有20yg/L肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子,5mM的L-鳥(niǎo)氨酸-α-酮戊二酸、0.51VL胰島素、 50mg/L還原型谷胱甘肽。
[0025] 實(shí)施例3
[0026]具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基3,以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,它含有10% 胎牛血清,還含有l(wèi)〇yg/L肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子,3mM的L-鳥(niǎo)氨酸-α-酮戊二酸、0.81VL胰島素、 50mg/L維生素 C。
[0027] 實(shí)施例4
[0028]具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基4,以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,它含有10% 胎牛血清,還含有15yg/L肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子,ImM的L-鳥(niǎo)氨酸-α-酮戊二酸、1.01VL胰島素、 12g/L谷氨酸鈉。
[0029] 實(shí)施例5
[0030]具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基5,以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,它含有10% 胎牛血清,還含有20yg/L肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子,5mM的L-鳥(niǎo)氨酸-α-酮戊二酸、0.5U/L胰島素、9g/ L谷氨酸鈉、0.5g/L精氨酸。
[0031] 實(shí)施例6
[0032]具有降氨能力的肝細(xì)胞培養(yǎng)基6,以RPMI 1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,它含有10% 胎牛血清