一種異佛爾酮類熒光探針及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熒光探針，具體涉及一種異佛爾酮類熒光探針及其制備與應(yīng)用， 屬于有機(jī)發(fā)光材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫化氫(H2S)-直以來都被認(rèn)為只是一種有臭雞蛋氣味的有毒氣體，但近年來發(fā) 現(xiàn)，它是繼一氧化碳和一氧化氮之后，可在生命體內(nèi)發(fā)揮生理作用的第三種氣體信號(hào)分子， 作為一種氣體遞質(zhì)，它不需借助任何特殊的載體就可以快速、自由的通過細(xì)胞膜，對(duì)一系列 生物靶點(diǎn)產(chǎn)生影響，參與機(jī)體多種功能的調(diào)節(jié)，如神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞生成、促血管生成、抗氧化 應(yīng)激等。
[0003] 20世紀(jì)90年代中期，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體可以內(nèi)源性產(chǎn)生H2S氣體，它在體內(nèi)主要靠?jī)煞N 途徑產(chǎn)生，一種是以體內(nèi)含硫的氨基酸如半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸等為底物，在 胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-0-synthase，CBS)、胱硫醚-γ -裂解酶（cystathionine-y-lyase，CSE)、半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶等催化作用下產(chǎn)生的；另一方法是非酶途徑，主要在糖的 氧化中由硫元素到H 2S，這一途徑的所有基本組成部分都存在體內(nèi)，包括還原型硫的提供。
[0004] 目前，對(duì)硫化氫生理功能及作用機(jī)制的研究正在進(jìn)一步進(jìn)行中，因而，發(fā)展快速、 靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)生物硫化氫的方法對(duì)硫化氫的功能研究具有巨大的推動(dòng)作用。
[0005] 傳統(tǒng)的檢測(cè)H2S的方法包括分光光度法及電化學(xué)法，但這兩種方法的檢測(cè)誤差較 大，而且只能測(cè)定血漿或組織勻漿中的出5,不能用于測(cè)定細(xì)胞甚至活體中的H 2S。相比之下， 熒光探針由于靈敏，快速，方法便捷，可以用于活體細(xì)胞檢測(cè)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多物質(zhì)的 檢測(cè)。因此，建立快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)硫化氫的方法已成為人們矚目的焦點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種異佛爾酮類熒光探針，能快速、靈敏、特異性檢測(cè) 硫化氫。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的異佛爾酮類熒光探針，結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0009] 該熒光探針的特征在于它本身在生理環(huán)境中有微弱熒光，與硫化氫特異性快速反 應(yīng)，可生成具有強(qiáng)熒光的產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)硫化氫的特異性檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供式I所示的熒光探針的制備方法，合成路線短，反應(yīng)條 件簡(jiǎn)單。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的異佛爾酮類熒光探針的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)式II化合物的制備：惰性氣體保護(hù)下，將異氟爾酮（3，5,5_三甲基-2-環(huán)己烯 酮）、丙二腈、吡啶加入反應(yīng)瓶中，乙醇為溶劑，加熱回流反應(yīng)18~24h，反應(yīng)結(jié)束后降至室 溫，反應(yīng)液采用硅膠柱層析提純，洗脫劑為V石油醚:V乙酸乙酯=2~5:1，得到式II化合物； 其中，所述的異氟爾酮與丙二腈的摩爾比為1:1~1:4。
[0013] ⑵式III化合物的制備:惰性氣體保護(hù)下，將式II化合物、對(duì)羥基苯甲醛及吡啶加 入反應(yīng)瓶中，乙醇為溶劑，加熱回流反應(yīng)4~18h，反應(yīng)結(jié)束后降至室溫，濃縮，加去離子水抽 濾，保留紅橙色濾餅，濾餅采用硅膠柱層析提純，洗脫劑為V二氯甲烷:V乙酸乙酯=1~3:1， 得到式III化合物;其中，所述的式II化合物與對(duì)羥基苯甲醛的摩爾比為1:1~1:4。
[0014] (3)式I化合物的制備：將式III化合物與2,4_二硝基氟苯、三乙胺加入反應(yīng)瓶中， 二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈為溶劑，室溫或加熱至50~80°C攪拌反應(yīng)8~36h，待反應(yīng)結(jié)束 后，濃縮反應(yīng)液得粘稠混合物，加去離子水洗滌3~5次，加入二氯甲烷萃取，分液留存二氯 甲烷層，加入無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到淺黃色固體粉末，粉末采用硅膠柱層析提純，洗脫 劑為V石油醚:V二氯甲烷= 0.5~1:1，得到式I所示的熒光探針純品；其中，所述的式III化 合物與2,4_二硝基氟苯的摩爾比為1:1~1:4。
[0015] 反應(yīng)路線如下：
[0017] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供式I所示的熒光探針在檢測(cè)生物、環(huán)境、食品硫化氫中 的應(yīng)用。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的異佛爾酮類熒光探針在檢測(cè)生物硫化氫中的應(yīng)用，可 通過以下步驟實(shí)現(xiàn):在待檢測(cè)體系中加入式I所示的熒光探針，配制其終濃度為5~20μΜ，37 °C下孵育lh，通過檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的；待檢測(cè)體系為組織上清液或細(xì)胞勻漿 液，通過熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，待檢測(cè)體系為細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，通過激光共聚焦顯微 鏡觀察活細(xì)胞熒光成像。
[0019] 本發(fā)明的異佛爾酮類熒光探針在檢測(cè)環(huán)境硫化氫中的應(yīng)用，可通過以下步驟實(shí) 現(xiàn):在待檢測(cè)體系中加入式I所示的熒光探針，使其終濃度為5~20yM，37°C下孵育lh，通過 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度;待檢測(cè)體系為被污染土壤、被污染水體或大氣污染塵埃。
[0020] 本發(fā)明的異佛爾酮類熒光探針在檢測(cè)環(huán)境硫化氫中的應(yīng)用，可通過以下步驟實(shí) 現(xiàn):在待檢測(cè)體系中加入式I所示的熒光探針，使其終濃度為5~20yM，37°C下孵育lh，通過 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度;待檢測(cè)體系為肉類勻漿液。
[0021] 本發(fā)明利用硫化氫的還原性或親核性，設(shè)計(jì)了可與硫化氫特異性反應(yīng)的熒光探 針，反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。本發(fā)明的熒光探針本身有微弱的熒光，與硫化氫反應(yīng)后可生成具 有強(qiáng)熒光的產(chǎn)物，因而可用于生物、環(huán)境、食品硫化氫的檢測(cè)。由于小分子熒光探針具有體 積小、生物膜通透性良好的優(yōu)點(diǎn)，因而熒光探針法除適用于檢測(cè)環(huán)境、食品、組織勻漿中的 硫化氫，還適用于活細(xì)胞中硫化氫的檢測(cè)。
[0022] 本發(fā)明具有以下有益效果：（1)穩(wěn)定性好，能夠長(zhǎng)期保存使用；（2)具有長(zhǎng)的熒光發(fā) 射波長(zhǎng)(592nm)，能夠有效避免來自生物大分子背景熒光的干擾；（3)具有優(yōu)秀的選擇性，不 受生命體中一些氨基酸等物質(zhì)的干擾，能特異性地檢測(cè)生物、環(huán)境、食品中的硫化氫；（4)具 有良好的生物膜通透性和低細(xì)胞毒性，適用于活細(xì)胞中硫化氫的檢測(cè)；（5)本發(fā)明的熒光探 針合成路線短，反應(yīng)條件溫和，具有很大的實(shí)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發(fā)明的熒光探針與硫化氫反應(yīng)的機(jī)理示意圖；
[0024] 圖2是本發(fā)明的熒光探針的核磁共振氫譜圖；
[0025] 圖3是本發(fā)明的熒光探針的熒光強(qiáng)度和硫化氫濃度變化的關(guān)系圖；
[0026] 圖4是本發(fā)明的熒光探針對(duì)生命體中一些氨基酸等物質(zhì)的響應(yīng)情況；
[0027] 圖5是本發(fā)明的熒光探針分子的濃度與細(xì)胞毒性的影響；
[0028] 圖6是本發(fā)明的熒光探針分子在細(xì)胞培養(yǎng)24h后的細(xì)胞抑制率圖；
[0029] 圖7是本發(fā)明的熒光探針分子檢測(cè)水溶液中硫化氫的熒光光譜；
[0030] 圖8是本發(fā)明的熒光探針分子檢測(cè)肉類食品中硫化氫的熒光光譜。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0032] 實(shí)施例1: 一種異佛爾酮類熒光探針的制備，包括以下步驟：
[0033] (1)式II化合物的制備：惰性氣體保護(hù)下，將異氟爾酮（l.Ommol)、丙二腈（1.0~ 4.0mmol)、吡啶(0. lmmol~0.4mmol)加入反應(yīng)瓶中，乙醇為溶劑，加熱回流18~24h，反應(yīng)結(jié) 束后降至室溫，反應(yīng)液采用硅膠柱層析提純，洗脫劑為V石油醚:V乙酸乙酯=2~5:1，得到 式II化合物純品；
[0034] (2)式III化合物的制備:惰性氣體保護(hù)下，將式II化合物（1.0_〇 1)與對(duì)羥基苯甲 醛(1.0~4.0mmol)及P比啶(0.1~0.4mmol)加入反應(yīng)瓶中，乙醇為溶劑，加熱回流4~18h，反 應(yīng)結(jié)束后降至室溫，濃縮，加入去離子水抽濾保留紅橙色濾餅，濾餅采用硅膠柱層析提純， 洗脫劑為V二氯甲烷:V乙酸乙酯=1~3:1，得到式III化合物純品；
[0035] (3)式1化合物的制備：將式111化合物（1.〇111111〇1)與2,4-二硝基氟苯（1.0~ 4.0mm〇l)、三乙胺（0.1~0.8mmol)加入反應(yīng)瓶中，二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈為溶劑，室溫 或加熱至50~80°C攪拌反應(yīng)8~36h，待反應(yīng)結(jié)束后，濃縮反應(yīng)液得粘稠混合物，加去離子水 洗滌3~5次，加