Prrsv美洲型經典株數字pcr絕對定量檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及試劑盒檢測技術領域，具體的說涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒美 洲型經典株數字PCR絕對定量檢測方法和檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙、尤其哺乳仔豬呼吸困難為特征的高度接觸 性傳染病。本病在1987年首次暴發于美國，隨后在加拿大、歐洲與亞洲相繼出現，目前已經 在世界范圍內流行，每年造成巨大的經濟損失。我國在1995年首次出現PRRS，隨后迅速蔓 延。2006年在我國全面暴發了體溫高、發病率高、死亡率高為主要臨床特征的豬"高熱病"， 而導致該病的病原是較之前在國內流行的經典PRRSV發生變異的高致病性豬繁殖與呼吸綜 合征病毒(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)。目前為止，PRRSV有兩種型，歐洲型和美洲 型，而美洲型又分為兩種亞型，經典美洲株和高致病性美洲株，三種亞型毒株在基因序列上 存在一定差異。我國國內主要流行的為美洲型毒株，而歐洲株在國內也偶有發現，因此在臨 床上需要一種能夠快速診斷PRRSV美洲型經典株的檢測方法。
[0003] 傳統的PRRSV檢測方法主要包括病毒的分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層實驗 (IPMA)、間接免疫熒光實驗（IFA)和間接酶聯免疫吸附實驗（間接ELISA)等。目前最常用核 酸檢測方法有反轉錄-聚合酶鏈反應實驗(RT-PCR)和熒光RT-PCR(Realtime RT-PCR)等實 驗。傳統的PRRSV檢測方法存在需要使用高成本儀器設備，試驗所需時間較長等不足。RT-PCR和Real time RT-PCR雖然較之以往方法具有特異性更強、靈敏度高、重復性好，且自動化 程度高等特點，但是上述方法均只能實現定性和半定量的檢測，無法對病毒核酸進行精確 定量，在靈敏度和敏感性特異性上仍存在一定的局限性。
[0004] 數字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在 1999年就由Bert Vogelstein采用并 發表相關文獻，其初衷是為了能夠從臨床樣品（如尿液、淋巴液、血漿、糞便等)大量的正常 體細胞中檢測出微量的突變細胞，但由于當時能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還 不能非常好地體現數字PCR的核心理念--"無限稀釋"（terminal dilution) jio-Rad公 司的QX200系統核心的微滴化技術能夠將一份樣品分成20,000個納升級的微滴，本質上將 傳統定量PCR的一個test變成20,000個test，大大提高了核酸序列檢測的靈敏度和精準度， 是對"無限稀釋"這一概念的完美演繹，其方法原理可稱為微滴式數字化PCR(Dr 〇plet Digital PCI^ddPCRhQXSOOddPCR系統包括兩臺儀器:微滴發生器和微滴分析儀，及其相關 的耗材。微滴發生器將每個樣品分成20,000個均勻的納升級微滴，其中每個微滴或不含待 檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。每個微滴都作為一個獨立的PCR反應 器。隨后微滴轉移至96孔PCR板上，開展終點PCR擴增。采用微滴分析儀(droplet reader)逐 個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0,最終根 據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數。 與傳統的定量PCR相比，數字PCR的精確度和靈敏度更佳。利用微滴式數字PCR技術，研究人 員可以檢測稀有突變，精確測定拷貝數變異，并對基因表達進行絕對定量。癌癥相關突變因 濃度較低，往往逃過檢測。憑借QX200系統的高靈敏度，研究人員如今可檢測濃度低至1/1， 000,000的靶分子。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、可實現 精確定量的數字PCR檢測方法和數字PCR檢測試劑盒，用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型 經典株的快速精確檢測。
[0006] 本發明的第一個技術目的是提供用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經典 株的特異性引物和探針組合，包括1對特異性引物和1條與引物對配合使用的特異探針，其 核苷酸序列分別為：
[0007] F：TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
[0008] R：GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
[0009] P：FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1〇
[0010] 本發明提供了上述的特異性引物和探針組合在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒美 洲型經典株檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。
[0011] 本發明提供了一種含有上述特異性引物和探針組合的試劑盒。所述試劑盒優選為 微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒。
[0012] 本發明的另一技術目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度和精確 度的、操作簡單的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經典株的檢測試劑盒，其中包含1對 特異性引物和1條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列分別為：
[0013] F：TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
[0014] R：GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
[0015] P：FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1〇
[0016] 還包含病毒總RNA提取試劑和檢測試劑;所述檢測試劑包括無 RNA酶的蒸餾水，一 步法ddPCR探針法預混液，探針法ddPCR微滴發生油，質控液，陰性對照和陽性對照。
[0017] 所述病毒總RNA提取試劑含有TRIzoL、氯仿或異戊醇、異丙醇。所述一步法ddPCR探 針法預混液其900μ1 的配方為：500yL的2X One-step RT-ddPCR Supermix for probes，上、 下游引物分別為90此，特異探針為40yL，引物和探針的濃度均為ΙΟμΜ，以及無 RNase酶蒸餾 水180yL。
[0018] 所述陽性對照為含有豬藍耳病美洲型經典株病毒基因組RNA的提取液，陰性對照 為無 RNA酶蒸餾水。
[0019] 本發明的試劑盒其工作原理是采用微滴式數字化PCR(ddPCR)，所述試劑盒的工作 程序為：
[0020] (1)配制ddPCR反應液;ddPCR反應液20μ1配方為：一步法ddPCR探針法預混液18μ1， 待測樣品RNA模板為2μ1;
[0021 ] (2)制備微滴，然后將微滴轉入PCR板，于PCR儀中進行擴增；
[0022] (3)將完成PCR擴增的PCR板放入微滴分析儀中，檢測微滴，分析數據，顯示檢測結 果。
[0023]在本發明的一個實施例中，制備微滴的方法是采用Bio-Rad公司的QX200系統中的 微滴發生器，按照說明書操作進行微滴制備即可。
[0024] 其中，步驟(2)中PCR的擴增程序為50°C反轉錄10min;95°C預變性10min;94°C變性 30sec，57~60°C退火60sec，共40個循環;98°C10min結束反應，每步都設置2.5°C/sec的降 溫速度。
[0025]本發明提供的試劑盒在豬疫病檢測和預防中的應用也屬于本發明的保護范圍。 [0026]本發明試劑盒檢測結果的判定方法為：（1)陽性對照:20±2個拷貝；（2)陰性對照： 〈1個拷貝；待測樣本結果判定：（1)陽性:標本檢測結果2 1個拷貝。（2)陰性:標本檢測結果〈 1拷貝。
[0027] 本發明摸索了引物和探針的濃度，找到了最適微滴式數字PCR的引物和探針的工 作濃度。摸索了 PCR反應過程中最適的升降溫速度，以提高數字PCR的擴增效率，使本發明方 法能夠與BI0-RAD公司的QX200系統相結合。
[0028] 本發明試劑盒具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、可直接定量，無需標 準曲線、操作簡便等優點，可以在疫情預爆發前便于在早期內確定疫病，做好預防，從源頭 控制疫情。具體表現在：
[0029] (1)高特異性:本發明根據豬藍耳病美洲型經典株病毒衣殼蛋白基因組序列設計 了特異性引物和特異探針，其特異性極高，且非常穩定，保證了反應的順利進行，進一步確 保豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經典株檢出的特異性；
[0030] (2)高靈敏度:檢測濃度低至1/1，000,000的靶分子;能夠直接定量待測樣本中的 拷貝數；
[0031] (3)低模板：由于檢測的靈敏度很高，可以檢測出低豐度的目的基因，所以可以降 低模板用量，稀釋模板濃度，對于一些珍貴，稀少的樣本可以有更多的研究。
[0032] (4)可直接定量，無需標準曲線：與傳統的PRRSV檢測方法相比，該試劑盒可直接定 量，無需標準曲線，操作簡便、準確無誤，有效預防豬疫病的大規模爆發。
【具體實施方式】
[0033]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。
[0034]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。 [0035]實施例1引物及探針的設計與篩選
[0036] 1、本發明引物、探針設計:根據Genbank已發表的豬藍耳病美洲型經典株病毒根據 Genbank已發表的豬藍耳病美洲型經典株病毒基因組序列KP771778.1，選擇N衣殼蛋白為靶 基因，進行適用于ddPCR的特異性引物和探針的設計為靶基因，進行適用于ddPCR的特異性 引物和的設計。
[0037] 本實施例給出了篩選最佳引物的過程，選擇用軟件設計出的其中幾對備選引物進 行篩選，備選引物如下，見表1。
[0038] 表1
[0039]
[0040] 2、引物的篩選
[0041] (1)引物隨機配為四對:F1R1、F1R2、F2R1、F2R2;
[0042] (2)然后用染料法做熒光定量PCR，PCR體系配方：2Xone-step SYBR Green Supermix 10yL，上游引物，下游引物分別為lyL，RNase Free dH2〇 3yL，陽性模板5μΙ^ΡΟ? 的擴增程序為50°C反轉錄10min;95°C預變性10min;94°C變性30sec，60°C退火60sec，共40 個循環;65°C-95°C每5秒升高0.5°C溶解曲線，結束反應。
[0043] (3)結果分析，選擇沒有非特異性擴增的引物對F2R2。
[0044] 3、探針的篩選
[0045] (1)引物探針的組合為：1、F2R2+P1，2、F2R2+P2
[0046] (2)然后在ddPCR平臺上，ddPCR體系配方：2X One-step RT-ddPCR Supermix 10μ L，上游引物，下游引物分別為lyL，探針0.5yL，RNase Free dH20 3.5yL，陽性模板4yL，總體 積20yL(引物和探針的濃度均為ΙΟμΜ)。然后生成微滴。
[0047] (3)上 PCR 儀擴增，為 50°C 反轉錄 10min;95°C 預變性 10min;94°C 變性 30sec，60°C 退 火60sec，共40個循環;98°C lOmin結束反應。上微滴數字PCR檢測儀檢測。
[0048] (4)分析結果:根據實驗結果選擇F2R2+P2引物探針組合。
[0049] 實施例2在ddPCR平臺上檢測豬藍耳病美洲型經典株病毒的PCR方法退火溫度的優 化。
[0050] 1、選擇引物探針的組合為:F2R2+P2。