人類cyp2c9和vkorc1基因多態性檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種人類CYP2C9和VKORCl基因多態性檢測的試劑盒，尤其涉及一種 快速有效地檢測少量樣本的CYP2C9和VKORCl基因多態性的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 華法林是目前臨床上使用最早、最多、最廣的口服抗凝藥，已被應用于多種疾病的 抗凝治療，如靜脈血栓栓塞性疾病（VTE)的一級和二級預防、心房顫動血栓栓塞的預防、瓣 膜病、人工瓣膜置換術和心腔內血栓形成等，但臨床療效和不良反應個體差異很大，劑量很 難掌握，尤其是在使用華法林抗凝治療初期，極易導致嚴重的出血并發癥。據估計，服用華 法林的患者中，每年有15. 2%的人發生出血副作用，其中致命性的大出血占3. 5%，不同個 體間華法林穩定劑量的差異可達20倍以上。
[0003] 華法林有兩種構象：R和S。其中S-華法林的作用占60~70%，而R-華法林只有 30~40%。S-華法林主要由CYP2C9代謝成無活性的代謝產物。CYP2C9的基因多態性決 定了華法林的使用劑量。有薈萃分析顯示，患者攜帶CYP2C9*2或CYP2C9*3變異需要一個 較低的華法林維持劑量，尤其攜帶有CYP2C9*3突變的患者表現更為明顯，大約減少30% 的劑量。
[0004] 突變導致CYP2C9酶活性降低，其活性僅為野生型的5 %，這種突變降低了酶活 性，使其底物的清除率降低，血藥濃度升高，因此，需降低臨床用藥劑量，防止不良反應的發 生。VKORCl基因是華法林作用靶點，目前已經有了一系列VKORCl基因多態與華法林劑量 的報道。在亞洲人群中研究結果顯示，VKORCl的基因多態對華法林劑量差異的影響達到 了 49. 5%，其中VKORCl基因-1639G>A位點，G和A等位基因的發生頻率分別為80. 5%和 19. 5%。與A等位基因相比，G等位基因增加了近40%的酶活性，從而可能引起華法林劑量 的差異。
[0005] 人工機械瓣膜置換術患者必須進行抗凝以預防血栓栓塞的形成，而華法林是常用 抗凝藥。華法林治療窗窄，臨床中華法林每日維持劑量在不同個體間可以相差20倍，引起 致命性和嚴重出血發生率分別為1. 3%和7. 2%，對患者生命健康構成極大威脅。CYP2C9和 VKORCl基因突變可解釋約50%的華法林用藥劑量個體差異，對指導華法林合理應用具有 巨大的指導意義。
[0006] 近年來隨著分子生物學的快速發展，大量研究表明，在中國，華法林代謝酶基因 CYP2C9基因*3等位基因型和華法林靶點基因 VKORCl基因-1639G/A基因型與其抗凝療效 密切相關，不同基因型患者所需華法林劑量差異明顯。美國FDA于2007年對華法林的說明 書進行了更新，強調醫護工作者要使用基因檢測來調整不同個體病人的合理初始藥劑量， 從而達到輔助優化華法林使用的目的，并降低出血風險。
[0007] 本發明試劑盒對人類CYP2C9基因 CYP2C9*3位點和VKORCl基因 VK0RC1-1639G>A 位點的多態性進行定性檢測，可輔助醫生對華法林藥物使用劑量及毒性反應進行預測。
[0008] 表1 :CYP2C9和VKORCl基因多態性 CN 105177116 A 說明書 2/8 頁
[0010] 目前針對基因多態性的檢測方法很多，如直接測序法，焦磷酸測序法，高分辨率溶 解曲線檢測法（High Resolution Melting Analysis，HRM)，焚光定量PCR法等。其中最常 見方法為測序法，該方法費用較低，但操作耗時長且靈敏度低；高分辨率溶解曲線法對設備 要求比較特殊，在臨床推廣存在一定的困難；傳統熒光定量PCR法在臨床上應用較為廣泛， 但該方法檢測基因多態性一般采用Genotyping方法進行檢測，該方法對樣本數量以及多 態性分布有一定要求，樣本量少時不能對樣本基因多態性進行準確檢測。因此，需要建立一 種快速有效的檢測少量樣本的CYP2C9和VKORCl基因多態性的方法。
【發明內容】
[0011] 本發明目的在于，克服現有技術中的不足，提供一種CYP2C9和VKORCl基因多態性 的檢測試劑盒，以此解決現有基因多態性檢測技術中，樣本量少時基因多態性檢測效果不 理想的問題。本試劑盒可用于高通量、低成本快速檢測CYP2C9和VKORCl基因多態性，其靈 敏度高，特異性強，可適用于用于Η)ΤΑ、檸檬酸鹽抗凝新鮮全血或血漿中提取的人類基因組 DNA的檢測。
[0012] 本發明提供了一種CYP2C9和VKORCl基因多態性的檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR 緩沖液，dNTP，HotStart Taq酶，UNG酶，2組特異性引物，2組特異性探針和內標系統。
[0013] 在本發明的一些實施方案中，所述2組特異性引物序列分別為SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2 與 SEQ ID N0:3;SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5 與 SEQ ID N0:6。
[0014] 在本發明的一些實施方案中，所述2組特異性探針序列分別為SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 10,且所述特異性探針5'端修飾有FAM或VIC，3'端 修飾有NFQ-MGB。
[0015] 在本發明的一些實施方案中，所述內標系統包含內標引物和內標探針。內標引物 序列為SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12,所述內標探針序列為SEQ ID NO: 13。在一些實施 方案中，所述內標探針5 '端修飾有R0X，3 '端修飾有BHQ2。
[0016] 在本發明的一些實施方案中，所述檢測試劑盒含有陽性對照液和空白對照液，所 述陽性對照液含有4種質粒DNA混合液，所述4種質粒DNA分別含有2種不同的CYP2C9等 位基因和2種不同的VK0RC1等位基因，所述空白對照為Tris-HCl緩沖液。
[0017] 本發明的CYP2C9和VK0RC1基因多態性檢測試劑盒可以簡單快速檢測基因多態 性，并且所述檢測包括以下步驟：（1)設計并篩選含有CYP2C9和VK0RC1的檢測探針，ARMS 引物，通用引物；⑵從非細胞體系或細胞體系中提取的基因組DNA作為模板DNA ; (3)進行 實時熒光定量PCR擴增：每個樣本的CYP2C9基因多態性和VKORCl多態性檢測分2管進行 PCR反應。
[0018] 本發明CYP2C9和VKORCl基因多態性檢測試劑盒采用Taqman探針法，建立了在同 一反應管檢測同一基因兩種不同多態性的多重熒光定量PCR檢測方法，本發明CYP2C9和 VKORCl基因多態性檢測試劑盒采用ARMS引物特異性擴增目的模板與SNP探針特異性識別 目的基因檢測的方法，對檢測同一基因兩種多態性提供更高效的特異性雙重保證，同時引 入內標系統和UNG酶防污染系統，能更加準確、穩定地對樣品進行分型檢測。本發明的試劑 盒具有以下優點：1.可以準確檢測單個樣品的基因型；2.可以準確檢測Ing基因組DNA的 基因型；3.針對CYP2C9和VKORCl的基因型設計ARMS特異性引物和SNP分型探針，可以特 異性擴增識別對應的多態性；4.使用熒光定量PCR技術進行檢測，檢測過程均為閉管反應， 顯著降低污染，并且加入UNG酶防污染系統，確保結果真實可信；5..在同一反應管中檢測 同一基因兩種多態性，操作簡便，能在90分鐘內完成檢測結果判讀方法簡單客觀，便于分 析。 圖1是CYP2C9*3A/*3A純合野生樣本23例中的一個檢測結果； 圖2是CYP2C9*3C/*3C純合突變樣本1例中的一個檢測結果； 圖3是CYP2C9*3A/*3C雜合突變樣本16例中的一個檢測結果； 圖4是VK0RC1-1639G/G純合野生樣本1例中的一個檢測結果； 圖5是VK0RC1-1639A/A純合突變樣本30例中的一個檢測結果； 圖6是VK0RC1-1639G/A雜合突變樣本9例中的一個檢測結果。
【具體實施方式】
[0019] 為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合 附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的【具體實施方式】僅僅 用以解釋本發明，并不限制本發明。
[0020] 本發明的一個實施方案提供了一種CYP2C9和VKORCl基因多態性的檢測試劑盒， 該試劑盒包括PCR緩沖液，dNTP，HotStart Taq酶，UNG酶，2組特異性引物，2組特異性探 針和內標系統。
[0021] 在一些具體實施方案中，所述PCR緩沖液中含有1.0~5. OmM的MgCl2,1.0~ 5. OmM 的 dNTP，即 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 0 ~5. OmM。
[0022] 在一些具體實施方案中，所述2組特異性引物序列為SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3 與 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6;其中 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2與SEQ ID