表達人白介素15的重組溶瘤腺病毒及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種表達人白介素15的新型重組溶瘤 腺病毒及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是威脅我國人民健康的重大疾病。傳統手術、化療和放療只減低了腫瘤 負荷，無法根治腫瘤的復發和轉移。由于惡性腫瘤的發生和發展有其分子遺傳學基礎，所以 基因療法有望成為腫瘤治療新的選擇。其中，對腺病毒進行基因改造使其靶向殺傷腫瘤細 胞同時避免對正常細胞的影響（即溶瘤腺病毒），已經成為腫瘤基因治療的新成員。
[0003] 為了實現溶瘤病毒的腫瘤靶向性，在其構建策略中，常常在病毒基因組中加載腫 瘤或組織特異性啟動子以啟動E1A、ElB或E4基因。由于E2F-1是一種在細胞周期的調節 過程中起重要作用的轉錄因子，其過表達既可引導靜止期細胞進入分裂周期，也可以調控 許多與細胞分裂有關的轉錄因子的表達。利用E2F-1基因在大多數實體腫瘤高表達的特 點，構建以E2F-1基因作啟動子調控ElA基因表達的溶瘤腺病毒能夠選擇性的在腫瘤細胞 中復制，而不影響正常細胞的功能，見CN00813593. 2。
[0004] 然而，由于機體存在抗病毒免疫，且腫瘤存在很強的免疫抑制網絡，單純溶瘤病毒 難以激發理想的免疫應答。最早被應用于臨床試驗的溶瘤病毒0NYX-015的試驗數據表明 其作為單一療法治療腫瘤抑瘤作用并不明顯，需要聯合輔助療法提高抗腫瘤作用。這促使 研究者在病毒基因組中插入免疫調芐基因使得病毒在直接殺傷腫瘤細胞的同時釋放免疫 調節因子，優化抗腫瘤免疫反應，這成為抗腫瘤"病毒-基因"策略新方向。
[0005] 基于這一思路，我們注意到IL-15是T細胞產生細胞因子及其受體的化學誘導劑， 可以促進T細胞增殖，長時間維持擴增的CTL細胞的活力并增加其細胞毒性，同時促進T細 胞產生IFN-γ、TNF-α等細胞因子從而增強其殺瘤活性。在IL-15的功能研究中，已有實 驗證實，IL-15不僅可以促進中性粒細胞、巨噬細胞的活性，對樹突狀細胞的功能起關鍵作 用；而且還可促進淋巴效應細胞，尤其是NK細胞、NKT細胞、B細胞和⑶8+Τ細胞的產生、激 活、歸巢和存活。IL-15能夠調節記憶性T細胞的存活和增殖，有效抑制Treg細胞對效應T 細胞的負向作用。因此，IL-15是非常具有潛力的用于腫瘤治療的細胞因子，以此構建溶瘤 病毒或可取得良好抗腫瘤效果。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種表達人白介素15的新型重組溶瘤腺病毒及其構建方 法。
[0007] 為了實現本發明目的，本發明提供了一種表達人白介素15的重組溶瘤腺病毒，其 是將5型腺病毒El區基因啟動子替換成轉錄因子E2F-1基因 （GenBank :S74230)，且在Ε3 區插入人白介素15基因，即hIL-15基因 （GenBank :HSU14407)而構建得到的重組溶瘤腺病 毒。
[0008] 本發明的表達人白介素15的重組溶瘤腺病毒的構建方法，包括以下步驟：
[0009] 1)質粒PXC20-E2Fp的構建：用EcoRI和XhoI雙酶切質粒P55-E2Fp，回收大小為 1088bp的DNA片段，同時用EcoRI和XhoI雙酶切質粒PXC20,回收大小為8965bp的DNA片 段，將上述兩個回收的DNA片段連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，涂布于含 AMP的瓊脂平板，挑取陽性克隆于含AMP的LB液體培養基中過夜培養，提質粒，酶切鑒定正 確后命名為PXC20-E2Fp。
[0010] 2)質粒PENTER12-IL2SP-IL15的構建：根據hIL-15基因序列設計PCR擴增引物，
[0011] 上游引物：
[0012] 5 ' -ACGCGTCGACTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTG-3 '，
[0013] 下游引物：
[0014] 5 ' -CCGGAATTCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATT-3 '，
[0015] 以質粒hIL2SPIL15為模板，進行PCR擴增，擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定正 確后，用EcoRI和Sail雙酶切擴增產物，回收大小為477bp的DNA片段；再用EcoRI和Sail 雙酶切質粒PENTER12,回收大小為3002bp的DNA片段，將上述兩個回收的DNA片段連接，連 接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，涂含AMP的瓊脂平板，挑取陽性克隆于含AMP的LB 液體培養基中過夜培養，提質粒，酶切鑒定正確后命名為PENTER12-IL2SP-IL15。
[0016] 3)質粒 PPE3-IL2SP-IL15 的構建：質粒 pPE3-RC 與 pENTER12-IL2SP-IL15 進行 LR 重組反應，所得產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，涂含AMP的瓊脂平板，挑取陽性克隆 于含AMP的LB液體培養基中過夜培養，提質粒，酶切鑒定正確后命名為PPE3-IL2SP-IL15。
[0017] 4)重組溶瘤腺病毒的制備：將質粒PXC20-E2Fp與PPE3-IL2SP-IL15共轉染至 ΗΕΚ293細胞，轉染后9-14天出現病毒空斑，經過病毒空斑純化，提取腺病毒DNA，進行PCR 鑒定。經鑒定正確的重組腺病毒命名為Ad-E2F1/IL15。
[0018] 前述的方法，步驟2)中進行PCR擴增hIL-15基因的反應條件為：94°C 5min; 94°C 40sec，56°C 40sec，68°C 90sec，共 30 個循環；68°C IOmin0
[0019] 前述的方法，步驟4)中質粒PXC20-E2Fp與PPE3-IL2SP-IL15通過 Lipofectamine2000 共轉染至 HEK293 細胞。
[0020] 本發明還涉及所述重組溶瘤腺病毒或所述方法在制備抑制腫瘤生長的藥物中的 應用。
[0021] 可選的，所述應用包括將所述重組溶瘤腺病毒與藥物可接受的載體混合制備藥 物。
[0022] 可選的，所述藥物可接受的載體包括但不限于PBS緩沖液、生理鹽水和細胞培養 液。其中，所述細胞培養液可以為含牛血清的1640培養液或DMEM培養液。
[0023] 本發明以E2F-1作為啟動子實現病毒特異性在腫瘤細胞內復制的同時，在病毒基 因 E3區裝載人IL-15基因可以進一步提高病毒抗腫瘤作用：（l)pRb/E2F通路缺陷廣泛存 在于實體腫瘤中，通過病毒的溶瘤作用，可獲得豐富的各種來自于個體自身的腫瘤抗原，且 不受抗原亞細胞定位的局限性，有利于產生具有自身腫瘤特異性的抗腫瘤免疫應答，具有 個性化和普遍性的治療意義；（2)病毒復制過程中帶動IL-15基因表達，在病毒感染的腫瘤 細胞局部獲得高濃度的IL-15,有利于刺激免疫細胞的活性，激活全身免疫反應，增強抗腫 瘤效果。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明實施例1中質粒PXC20-E2Fp的構建流程示意圖。
[0025] 圖2為本發明實施例1中質粒PXC20-E2Fp的酶切鑒定結果；其中A :Mix DNA Ladder ;B :EcoRI+XhoI 酶切，M :Mix DNA Ladder，1-6 為 PXC20-E2Fp 的 6 個克隆；C :M : Mix DNA LadderI, EcoRI+XhoI 8965bp+1088bp,2 ：AgeI+XhoI 9771bp+282bp, 3 ：EcoRV 9158bp+895bp，4 :HINDIII 6725bp+3328bp，5 :NheI+XbaI 8390bp+1163bp，6 :BstXI 6059bp+3672bp+322bp，7:HincII 5139bp+2581bp+2333bp，8 :PvuII 3473bp+2226bp+1861 bp+1482bp+908bp+76bp+27bp〇
[0026] 圖3為本發明實施例1中質粒pENTER12-IL2SP-IL15的構建流程示意圖。
[0027] 圖4為本發明實施例1中LR重組反應示意圖。
[0028] 圖 5 為本發明實施例 1 中質粒 pENTER12-IL2SP-IL15 和 PPE3-IL2SP-IL15 的 酶切鑒定結果；其中，A :M :Mix DNA Ladder，M 左為 XbaI 酶切：2280bp+1199bp，M 右 為 XhoI+EcoRV 酶切：2633bp+846bp ;B :M1 :Mix DNA Ladder，M2 : ADNA EcoRI+Hindlll marker,I ：HindIII 8010bp+6034bp+5322bp+4597bp+4360bp + 2937bp+2791bp + 2 081bp+1522bp+75bp，2 :EcoRI 23815bp+8564bp+3159bp+2121bp+70bp，3 :XbaI 27716bp+7468bp+1346bp+1199bp，4 :BamHI 20674bp+14913bp+1741bp+401bp，5 :SalI 14221bp+6903bp+6037bp+6006bp+4183bp+379bp,6 ：SpeI 34330bp+3399bp,7 ：XhoI 14500bp+8322bp+4995bp+4908bp +2466bp+1445bp+595bp+498bp,8 ：EcoRV 8904bp+7637bp +4546bp+3840bp+2990bp+2623bp+2542bp+2052bp+1357bp+1238bp,9 ：NheI 11917bp+10342 bp+6192bp+4743bp+3848bp+687bp, 10 ：XbaI+SpeI 26206bp+7468bp+1510bp+1346bp+656bp +543bp,11 ：PacI 36422bp+991bp+316bp ；C ： λ DNA EcoRI+Hindlll marker〇
[0029] 圖6為本發明實施例1中HEK293細胞內重組示意圖。
[0030] 圖7為本發明實施例1中溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15的PCR鑒定結果；其中，N :陰 性對照；Pl :PXC20 質粒；P2 :PXC20-E2Fp 質粒；P3 :PPE3-IL2SP-IL15 質粒；1-2 :Ad-E2Fl/ IL15 病毒的 2 個克隆；M :Mix DNA Ladder。
[0031] 圖8為本發明實施例1中重組腺病毒Ad-E2F1/IL15的DNA結構示意圖。
[0032] 圖9為本發明實施例1中重組腺病毒Ad-E2F1/IL15構建總流程圖。
[0033] 圖10為本發明實施例2中溶瘤腺病毒對細胞增殖的影響。
[0034] 圖11為本發明實施例3中Ad-E2F1/IL15感染的細胞培養上清中IL-15蛋白含量。
[0035] 圖12為本發明實施例4中不同重組腺病毒局部注射后腫瘤生長曲線比較。
[0036] 圖13為HEK293細胞的培養。
[0037] 圖14為病毒的擴增。
[0038] 圖15為50%組織培養感染劑量法測定病毒滴度。
【具體實施方式】
[0039] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0040] 實施例1表達人白介素15的重組溶瘤腺病毒及其構建方法
[0041] 1、實驗材料及試劑
[0042] 質粒PXC20及腺病毒骨架質粒pPE3-RC由由上海東方肝膽外科醫院病毒及基 因治療實驗室提供。攜帶hIL-15基因的質粒hIL2SPIL15。限制性內切酶EcoRI、Xhol、 Sail、PvuII、NcoI等購自美國NEB公司，DNA連接酶溶液I購自TakaRa公司，膠回收試劑 盒、PCR產物回收試劑盒、質粒DNA制備試劑盒、病毒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司， LipofectAmine2000試劑盒購自GIBCO BRL公司。人胚腎293細胞（HEK293細胞）購自加 拿大MICROBIX BI0SYSTEMS公司，人結腸癌細胞系SW620和人胚胎成纖維細胞系Wi38由中 國人民解放軍總醫院普通外科研究所提供。MTT購自美國Sigma公司，IL15的ELISA檢測 試劑盒購自美國BD公司。
[0043] 2、主要實驗儀器
[0046] 3、實驗方法