腸桿菌耐草甘膦基因argF、編碼蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腸桿菌耐草甘膦基因 argF、編碼蛋 白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因資源的獲得是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因育種的關(guān)鍵，抗草甘膦基因可分為靶基因和非 靶基因。草甘膦在細(xì)胞中的靶標(biāo)是芳香氨基酸生物合成中的關(guān)鍵酶5-烯醇丙酮酸-莽草 酸-3_磷酸合酶（EPSPS)，EPSPS僅在細(xì)菌和植物中存在（SteinrUcken&Amrhein，1980)， 參與莽草酸途徑合成生物體所必須的芳香族氨基酸，在細(xì)胞對(duì)草甘膦的耐性中起著重要作 用。除靶基因外，抗草甘膦生物中非靶基因的研究也受到一定的關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)的非靶基因 包括C-N鍵氧化裂解基因，如草甘膦氧化還原酶基因 GOX ;參與裂解C-P鍵的C-P裂解酶；磷 酸轉(zhuǎn)移酶基因 glpA、glpB和igrA，甘氨酸氧化酶基因 GO ;草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 GAT使 草甘膦發(fā)生乙?；?，無(wú)法與EPSPS結(jié)合，將草甘膦轉(zhuǎn)化為低毒的乙酰草甘膦；此外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 能夠主動(dòng)運(yùn)輸某些磷酸化合物，推測(cè)草甘膦也可能被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)出細(xì)胞外（朱金文，2008， 李亮，2010, Pollegioni, et al.，2011)。
[0003] 抗草甘膦基因被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因育種研究，如Barry將細(xì)菌中獲得的GOX轉(zhuǎn)入 小麥獲得了抗性植株（Barry，2002) Jazquez也將磷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化煙草，提高了其抗 性（Penaloza-Viizquez, et al.，1995) ;Smart等則證實(shí)過(guò)表達(dá)EPSP合酶能夠提高植物的抗 性（Smart, et al.，1985);謝龍旭將抗性基因 aroAM12轉(zhuǎn)入棉花得到抗草甘膦的棉花（謝 龍旭，et al.，2004,劉錫娟，2007)。在目前被挖掘的一系列抗性基因中，已被用于商業(yè)化 轉(zhuǎn)基因作物中的有aroA-cp4(根癌土壤桿菌）、G0X (人蒼白桿菌）、2mepsps(玉米的雙突變 EPSPS)、gat (地衣芽孢桿菌）、epsps (Ag)(球形節(jié)桿菌）、mepsps (玉米的經(jīng)修飾的EPSPS)、 epsps grg23ace5(人工合成的類似于epsps(Ag)的基因）。
[0004] 由于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因中除靶基因的耐草甘膦能力較強(qiáng)外，目前大部分挖掘的基因 耐性較弱，挖掘的基因相對(duì)較少。生物對(duì)草甘膦的抗性涉及大量調(diào)控不同層面抗性的相關(guān) 基因 （Fei et al.，2013)，因此挖掘不同層面且耐草甘膦能力強(qiáng)的基因?qū)共莞熟⑥D(zhuǎn)基因 育種至關(guān)重要。
[0005] 基因 argF編碼鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶，該轉(zhuǎn)移酶利用鳥氨酸合成精氨酸，在各種 生長(zhǎng)環(huán)境中該基因都被反向調(diào)節(jié)，過(guò)多或過(guò)少的精氨酸或其他C源都會(huì)抑制argF的表達(dá) (Voellmy&Leisinger, 1978)，該基因的下調(diào)一方面能夠使鳥氨酸積累，具有抗?jié)B透的作用， 另一方面可以幫助合成其他氨基酸如脯氨酸、芳香族氨基酸等（Weglenski，1967)。
[0006] 目前，國(guó)內(nèi)外已克隆多個(gè)對(duì)草甘膦有一定抗性的突變體基因。新基因的分離和 克隆對(duì)轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物的培育及防止抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生交叉抗性，具有重要意 義。本發(fā)明就是從草甘膦抗性進(jìn)化的腸桿菌中分離得到了具有耐草甘膦能力的基因 argF。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] I、發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0008] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種腸桿菌耐草甘膦基因 argF〇
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供耐草甘膦基因 argF所編碼的蛋白。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述抗性基因的重組載體。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述基因或重組載體在調(diào)控植物對(duì)草甘膦抗性及培 育耐草甘膦作物品種中的應(yīng)用。
[0012] 2、技術(shù)方案
[0013] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0014] -種腸桿菌中耐草甘膦基因 argF，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO. 1所示。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種耐草甘膦基因 argF所編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表 Seq ID NO. 2 所示。
[0016] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種含有該耐草甘膦基因 argF的重組載體，是將耐草甘 膦基因 argF插入pMDC83植物過(guò)表達(dá)載體中而成的。
[0017] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了擴(kuò)增所述耐草甘膦基因 argF全長(zhǎng)或其任意片段的引物 對(duì)，該引物對(duì)的上游引物如序列表Seq ID No. 3所示，下游引物如序列表Seq ID No. 4所示。
[0018] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述耐草甘膦基因 argF或所述重組載體在調(diào)控植物對(duì) 草甘膦抗性中的應(yīng)用。
[0019] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述耐草甘膦基因 argF或所述重組載體在培育耐草甘 膦作物品種中的應(yīng)用。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，就是將所述耐草甘膦基因 argF通過(guò)重組載體導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物抗草甘膦性高于所述 目的植物。
[0021] 3、有益效果
[0022] ⑴本發(fā)明所提供基因 argF的功能是參與腸桿菌耐草甘膦脅迫應(yīng)答反應(yīng)，過(guò)量表 達(dá)argF的擬南芥與未轉(zhuǎn)基因的擬南芥相比，耐草甘膦的能力得到顯著提高，表明該基因?qū)?提高植物的耐草甘膦方面起著一定的作用。
[0023] ⑵本發(fā)明的argF可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物耐除草劑的能力，以進(jìn)行植 物品種改良，所編碼的蛋白質(zhì)具有耐逆功能。
[0024] ⑶利用任何一種可以導(dǎo)入外源基因并在植物中表達(dá)的載體，可將本發(fā)明argF基 因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得耐草甘膦能力得以提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0025] ⑷使用本發(fā)明的基因 argF構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上 任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及 篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因（GUS基 因、熒光素酶基因等）或具有抗性的抗生素標(biāo)記物（慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）。 從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以除草劑逆境篩選轉(zhuǎn)化植 株。
[0026] (5)攜帶有本發(fā)明argF的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載 體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并 將轉(zhuǎn)化的植物組織培養(yǎng)成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物如水稻、小麥、玉米 等，也可以是雙子葉植物如大豆、黃瓜、苜蓿、番茄等。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為本發(fā)明腸桿菌中耐草甘膦基因 argF的克隆PCR檢測(cè)電泳圖。
[0028] 圖2為基因 argF在工程菌大腸桿菌BL21中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況分析（SDS-PAGE 圖）；注：marker 從上至下分別是 116. 0KD、66. 2KD、45. 0KD、35. 0KD、25. 0KD、18. 4KD、 14. 4KD，圖從左往右分別是marker、誘導(dǎo)前對(duì)照、誘導(dǎo)后菌的總蛋白、總蛋白經(jīng)超聲波裂解 后的沉淀、總蛋白經(jīng)超聲波裂解后的上清。
[0029] 圖3為工程菌大腸桿菌BL21對(duì)草甘膦的耐性分析圖。
[0030] 圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代陽(yáng)性苗（潮霉素抗性）的效果圖。
[0031] 圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代陽(yáng)性苗argF基因插入情況的PCR檢測(cè)電泳圖。
[0032] 圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥耐草甘膦性狀分析對(duì)比圖；注：對(duì)生長(zhǎng)了約14天的植株進(jìn)行 草甘膦（終濃度〇. 5mM)的48h的處理，觀察其表型。
[0033] 圖7為草甘膦處理下argF在擬南芥中的表達(dá)分析圖；注：對(duì)生長(zhǎng)了約14天的植株 進(jìn)行草甘膦（終濃度0. 5mM)的24h的處理，每隔6h取一次樣。
[0034] 圖8為基因 argF與革巴基因 aroA關(guān)系的信息學(xué)分析圖。
[0035] 圖9為細(xì)菌雙雜中基因的westernblot驗(yàn)證的PCR檢測(cè)電泳圖；注：基因 argF編 碼的蛋白大小為47KD，Marker從上至下分別是100、70、50、40、30、25KD。從圖中可以看到 基因得到了良好的表達(dá)。
[0036] 圖10為細(xì)菌雙雜圖；注：圖中1為陽(yáng)性對(duì)照；2、3為陰性對(duì)照；4為雙雜實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 實(shí)施例1 :腸桿菌耐草甘膦基因 argF的克隆
[0040] (1)設(shè)計(jì)引物，提取微生物腸桿菌DNA :
[0041] 用細(xì)菌總DNA提取試劑盒（購(gòu)自天根公司）提取微生物腸桿菌 (Enterobacteriaceae)的DNA，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的大腸桿菌argF基因序列設(shè)計(jì)引 物進(jìn)行同源克隆。擴(kuò)增的引物序列為：
[0042] Seq ID NO. 3 :