山核桃miR398a在降低植物重金屬脅迫耐受性中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因功能領域，更具體地涉及在降低植物重金屬脅迫耐受性中的應 用。
【背景技術】
[0002] MicroRNA (miRNA)是一類廣泛存在于動植物中，含有莖環結構的miRNA前體，經過 Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子（18-25個核苷酸）。miRNA通過在轉錄水平或 者轉錄后水平對基因組上的靶基因抑制其翻譯或者切割靶基因來調控基因表達，在基因表 達中起負調控其靶基因作用。
[0003] 在已知的眾多參與植物抗逆過程的miRNA中，miR398a是第一個被發現受逆境脅 迫負調控的miRNA。miR398a靶向兩種Cu/Zn過氧化物歧化酶（CSD):細胞質CSDl和葉綠 CSD2。CSD是植物抵御活性氧（ROS)毒害的主要超氧化物歧化酶（SOD)，這暗示miR398a可 能在氧化脅迫響應中發揮作用。
【發明內容】
[0004] 本發明提供了山核桃miR398a在降低植物重金屬脅迫耐受性中的應用。
[0005] 山核桃miR398a在降低植物重金屬脅迫耐受性中的應用，所述山核桃miR398a的 喊基序列如SEQ ID NO. 1所不。
[0006] 優選地，所述重金屬是Cu2+或Zn 2+。
[0007] 優選地，所述植物是擬南芥或煙草。
[0008] 優選地，所述植物是擬南芥。
[0009] 獲得山核桃miR398a轉基因植株方法包括：將包含所述山核桃miR398a的前體基 因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到擬南芥，篩選、培養和獲得轉基因株系。
[0010] 由于山核桃miR398a本身序列很短，只有21個bp，而其前體序列相對較長，連接到 載體上，有利于轉化實現，優選地，所述前體基因的堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本發明公開了山核桃miR398a在降低植物重金屬脅迫耐受性中的應用。通過敲除 山核桃的miR398a基因，有望增強山核桃的重金屬脅迫的耐受性，并使研究人員進一步了 解植物受金屬脅迫的耐受性。
【附圖說明】
[0012] 圖1為山核桃花芽的總RNA
[0013] 圖2為山核桃miR398a前體的中間載體菌液PCR檢測
[0014] 圖3為山核桃miR398a前體的表達載體菌液PCR檢測
[0015] 圖4為山核桃miR398a轉基因擬南芥植株的抗性篩選
[0016] 圖5為野生型和山核桃miR398a轉基因型擬南芥的葉綠素熒光測定圖
[0017] 圖6為野生型和山核桃miR398a轉基因型擬南芥的葉綠素熒光測定指標：A非光 化學淬變；B光化學淬變；C電子傳遞速率D PSII原初光化學效率；E有效量子產量
[0018] 圖7為野生型和山核桃miR398a轉基因型擬南芥的保護酶測定指標：A過氧化氫 酶活性；B過氧化物岐化酶活性；C超氧化物岐化酶活性
【具體實施方式】
[0019] 1.材料
[0020] I. 1實驗材料
[0021] 山核桃花芽采自浙江省杭州市臨安板橋村，選取不同株山核桃樹進行采樣。樣品 采下后立即液氮保存，帶回實驗室并放置在-80°C冰箱保存待用。
[0022] 1. 2實驗試劑與儀器
[0023] DNA聚合酶、各種限制性內切酶、T4連接酶、Marker和TRIzol試劑均購自寶生物 工程（大連）有限公司；質粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份 有限公司。PCR儀為美國PE9700PCR儀，超凈工作臺購自蘇州誠凈凈化科技有限公司。
[0024] 1.3引物合成及測序
[0025] 引物合成及測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
[0026] 2.方法
[0027] 2. 1山核桃花芽總RNA的提取
[0028] 采用改良CTAB+Trizol法提取花芽樣品總RNA，步驟如下：
[0029] (1)在IOmL離心管中加入3mL 65°C預熱的CTAB提取緩沖液（10% CTAB，10% PVP40，1.0M Tris-HCl(pH 8.0)，5M NaCl，0.6M EDTA(pH 8.0))，加入200 μLβ-巰基乙醇；
[0030] (2)取_70°C保存的花芽2g，放入液氮充分預冷的研缽中，于液氮中充分研磨至百 色粉末；
[0031] (3)將白色粉末迅速轉入預熱的提取液中，立即充分振蕩混勻，65°C水浴30min， 期間振蕩3-4次；
[0032] (4)在混合物中加入等體積的25:24:1 (酸性飽和酚：氯仿：異戊醇），約3ml。混 合均勾后HOOOrpm離心10min (常溫）；
[0033] (5)取上清轉入新的IOml離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1)上下顛倒 混勾，12000rpm4°C離心10min后取上清；
[0034] (6)重復步驟4 一次，直至中間層消失；
[0035] (7)上清轉移至I. 5mL離心管中，加入等體積的異丙醇后放置于_20°C冰箱冷凍 30min。12000rpm4°C離心10min棄掉上清，沉淀加入65°C預熱好的SSTE400 yL溶液至全 溶；
[0036] (8)溶液中加入ImLTRIzol試劑，室溫靜置5min。再加入200 μ L氯仿搖勻，室溫 靜置 2_3min ;
[0037] (9) 4。〇 12000rpm 離心 15min ;
[0038] (10)吸取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置IOmin ;
[0039] (11) 4°C 12000rpm離心10min，棄掉上清，肉眼可見RNA沉于管底；
[0040] (12)加入ImL預冷的75%乙醇洗滌沉淀，溫和振蕩，8000rpm4°C離心5min，棄掉上 清；
[0041] (13)重復步驟11，并將沉淀真空干燥7-10min ;加入適量DEPC水溶解沉淀，-80°C 保存備用。
[0042] 2. 2 cDNA 合成
[0043] 使用 TAKARA 試劑盒 Prime ScriptTM II 1st Strand cDNASynthesis Kit，詳細內 容如下：
[0044] (1)在經過DEPC處理過的PCR管中配置下列反應體系：
[0046] (2) 65 °C保溫5min，冰上迅速冷卻。（模板RNA變性）
[0047] (3)再次配置反應體系如下：
[0049] (4)緩慢搖勻。
[0050] (5) 42 cC 反應 30-60min。
[0051] (6)95°C 5min酶失活后，冰上冷卻。
[0052] 2. 3前體序列的引物設計
[0053] 依據山核桃的 miR398a 前體序列：ACGGAAGTACTGAGGTGTAGTACATTTTTTTAGGTAAAGT ACTGATTTAAAAGTGTTGCTGTGGCTATATAACATGGAATATCTTTCTCCATTGGCATCACCAGATTGTGGGGAAAG AGGCAAGAAAGTCGTGTAAATTAAAGGTGGATGAGCCTTACAGGGGCAACATGAGATCACATGTGGGCATTCTTATT ATTCACATGACACCCTTTCTGCTTGTGTTCATGTGTCCTATAGACTACAAATGTGTTCTCAGGTCGCCCCTGCAGGA CTTTCCTCCACCGCATGATCATGATCATGGTGATGCAATCGGCTTGATGGTTTTAAGCTGGCAATAATCATAGCTTA ATAGCCAGGTCAGCAAGGTCATCTTCCCCAACTCCTTTCCAAATCCCACCGATCATGAGATGGCCTTTGACACTACT TTCCTTTAATGGATTTCTCTTGCTGGGTGAGAAGGTCTGTCACAGATGCGAT，使用 Primer Primer 5. 0 設 計引物，引物兩端分別加上酶切位點KpnI和Xbal，正向引物：5'-GGGGTACCAATATCTTTCTCCA TTGGCATC-3' 反向引物：5' -GCTCTAGAATCGCATCTGTGACAGACCTTC-3，，克隆所需序列。
[0054] 2. 4 PCR擴增反應
[0055] 以山核桃cDNA為模板擴增，反應體系如下：
[0058] PCR 反應條件為：94°C預變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin。 30個循環后，72°C延伸lOmin。PCR反應完成后4°C暫時保存，其中退火溫度可根據Tm值進 行調整。
[0059] 2. 5瓊脂糖凝膠電泳檢測與膠回收
[0060] 將PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為TAE(40mM Tris-乙酸鹽， ImM EDTA)，核酸燃料為EB。紫外光檢測電泳結果并回收PCR產物。利用上海生工公司的 DNA膠回收試劑盒進行膠回收，具體步驟如下：
[0061] (1)通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的DNA片段與其他片段分開，用干凈的手術 刀片將含有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊切下，放入I. 5mL離心管中。每個膠塊盡量不要超過 400mg，否則將會導致溶膠不完全。另外切膠過程應盡可能快，從而減少DNA在紫外線中暴 露時間來降低對DNA的損傷。
[0062] (2)根據膠塊的質量和濃度，每IOOmg瓊脂糖加300~600 μ L的比例加入Buffer B2〇
[0063] (3)置于55°C金屬浴lOmin，期間混勻2~3次直至膠塊完全溶化為止。
[0064] (4)當目的片段< 500bp時，可加入1/3體積的Buffer B2的異丙醇，混勻。若 彡500bp，則此步驟可以省略。
[0065] (5)將溶化好的溶液全部移入吸附柱，8, OOOxg離心30s。倒掉收集管中的液體，并 將吸附柱放入同一個收集管中。
[0066] (6)加入500 μ L Wash Solution，9000xg離心30s。再次倒掉收集管中的液體。
[0067] (7)重復一次步驟6。
[0068] (8)將帶有收集管的吸附柱放入離心機，9000xg空離lmin。扔掉收集管，并將吸附 柱置于滅過菌的I. 5mL EP管中。
[0069] (9)打開吸附柱的蓋子，室溫放置lOmin。為了去除殘留的酒精，否則會嚴重影響 回收得率和后續實驗結果。
[0070] (10)在吸附膜中央加入15-3(^1^(1(1!120。室溫靜置51^11，900(^離心11^11。1.51^ EP管底部收集的DNA溶液即為回收的DNA，-20°C保存。
[0071] 2. 6 DNA回收片段與PMD-19