一種用于檢測食管鱗癌相關血清miRNAs基因的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種用于檢測食管鱗癌相關血清miRNAs基因的試劑盒。
【背景技術】
[0002]MicroRNAs CmiRNAs)是一類在序列上高度保守的內源性非編碼單鏈小RNA，長約19_25nt (Finnegan EF 等，MicroRNA b1genesis: regulating the regulators.CritRev B1chem Mol B1l, 2013, 48(1): 51-68)。miRNAs在許多基因的轉錄后調控中發揮重要的作用。每一個miRNA可以識別數百個靶基因的mRNAs，單個miRNA的失調可以影響整個基因網絡。miRNAs基因總數遠少于mRNAs，是易于篩選和驗證的生物標志物(Lu J等，MicroRNA express1n profiles classify human cancers.Nature, 2005, 435(7043):834-838)o不同的癌癥類型具有特異miRNAs表達譜。此外，在癌癥的發生、發展、轉移和治療中miRNAs異常變化可以闡明癌癥的演變機理。因此，越來越多的研究人員正在將研究重點轉向miRNA和腫瘤之間的關系上。
[0003]在世界范圍內，食管癌的死亡率高居癌癥死亡率的第六位，而男性的發病率是女性的3-4 倍(Jemal A 等，Global cancer statistics.Ca Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90)。食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)發生在食管中部或上部1/3，是亞洲食管癌的主要病理亞型，約占食管癌的90%以上(Song YM等，Identificat1nof genomic alterat1ns in oesophageal squamous cell cancer.Nature, 2014,509(7498): 91-95)。由于我國地處“食管癌帶”，食管鱗癌的發病率和死亡率均居世界首位。在臨床上，食管鱗癌的早期診治可以顯著地改善病人的預后并降低死亡率，但目前尚缺乏食管鱗癌特異性的生物標志物及有效的微創早期診斷方法。故食管鱗癌患者在確診時已有 50% 以上為中晚期(Zhang C 等，Cytoplasmic express1n of the ELAV-1ike proteinHuR as a potential prognostic marker in esophageal squamous cell carcinoma.Tumor B1l, 2014, 35 (I): 73-80)，其5年生存率在淋巴結無轉移時為20%_30%，而有淋巴結轉移時為13%。盡管傳統的血清腫瘤標志物，如癌胚抗原、鱗狀細胞癌抗原已經被用來早期診斷和檢測某些腫瘤的動態變化，但這些血清腫瘤標志物與食管鱗癌之間缺乏足夠的靈敏度和特異性。因此，尋找敏感、特異的食管鱗癌早期檢測的生物標志物既是降低發病率和死亡率的迫切需求，也成為當前研究的一個活躍領域。
[0004]由于血清miRNA容易獲得，是一個相對無創的采樣方式，同時由于血清miRNA非常穩定，重現性好，可以抵抗RNase A的消化和苛刻的環境(如反復凍融、長時間室溫放置、過酉愛過喊、極端 pH 等)(Chen X 等，Characterizat1n of microRNAs in serum: a novelclass of b1markers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res, 2008,18(10): 997-1006)，所以自2008年首次報道循環miRNA可作為潛在的腫瘤診斷工具后，關于血清miRNAs作為診斷、預后和早期預測人類疾病的科學文獻呈現指數增長(Jarry J等，The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges andcontradict1ns.Mol Oncol, 2014, 8(4): 819-829)。其中一些研究發現，血清miRNAs含量具有腫瘤特異性改變，說明血清miRNAs具有作為癌癥生物標志物的潛能(Komatsu S等，Circulating miR_18a: a sensitive cancer screening b1marker in human cancer.1nVivo, 2014, 28(3): 293-297)。血清miRNA既可來自癌組織，也可來自正常組織。在血清中miRNA與蛋白質、脂類、外分泌體等形成復合物，從而保持較高的穩定性。有些來自正常組織的血清miRNA可以作用于腫瘤細胞，補充癌細胞內下降的miRNA。一旦這種作用不能發揮，腫瘤細胞將進入轉移階段。因此，血清miRNA的高低可以反映腫瘤發展的動力學變化，對腫瘤的診斷治療和預后提供生物標志物。
[0005]隨著血清miRNA研究的深入，其作為一種疾病特別是腫瘤微創早期診斷方法也日益受到人們的青睞。有研究表明，血清miRNA與食管鱗癌的發生發展關系非常密切，可能成為食管鱗癌診斷和預后的生物標志物。最近的研究表明，血清miRNAs與食管鱗癌診斷和預后相關，這表明它們也可作為診斷和預后分類的潛在標志物，有助于在食管鱗癌早期篩選出適當的治療方法。張春妮課題組以miR-25、miR-100、miR-193_3p、miR-194、miR-223、miR-337-5p、miR-483-5p為一組，在111例ESCC病人和111例正常人中檢測它們的含量變化(Zhang CN等，Express1n profile of microRNAs in serum: a fingerprintfor esophageal squamous cell carcinoma.Clin Chem, 2010, 56(12): 1871-1879)和以 miR-22、miR-100、miR-10a、miR_148b、miR-223、miR_133a、miR-127_3p 為另一組，在290例ESCC病人和140例正常人中檢測它們的含量變化(Wu CY等，Diagnostic andprognostic implicat1ns of a serum miRNA panel in oesophageal squamous cellcarcinoma.Plos One, 2014, 9(3): e92292)，結果發現這些血清 miRNAs 在 ESCC 病人中含量均顯著高于正常人，而在其他腫瘤中無此變化，從而提出這兩種組合可作為食管鱗癌的診斷標志物。此外，許多研究對血清miRNAs受試者工作特征曲線(Receiveroperating characteris-tic curve, ROC)進行分析，并計算 ROC 曲線下面積(Area undercurve, AUC)來評估候選的血清/血楽miRNAs對食管鱗癌的預測能力。AUC越接近1，準確性越高，相關文獻中AUC大多數都顯示較高的準確性(Zou KH等，Receiver-operatingcharacteristic analysis for evaluating diagnostic tests and predictive models.Circulat1n, 2007，115(5): 654—657)。
[0006]—種血清miRNA作為腫瘤診斷標志物往往特異性較低，若測定多種miRNAs組合和miRNA表達譜可提高診斷的準確性，但是后者測定費時且費用較高，影響其廣泛應用。因此，選擇適當的miRNA測定其比率變化則可以用較少的測定獲得較高的準確性。Komatsu等研究結果顯示，用血漿中miR-21和miR-375含量的比率變化作觀測指標，可以改善血漿的miRNA用作診斷的生物標志物的靈敏度和特異性。相對單個miRNA的AUC，miR-21和miR-375含量比率的AUC值為0.816。在血漿中，miR-21和miR-375含量的比率可以區分健康人和食管癌患者，具有88%的敏感性和70%的特異性(Komatsu S等，CirculatingmicroRNAs in plasma of patients with oesophageal squamous cell carcinoma.BrJ Cancer, 2011, 105(1): 104-111)。Wang 等用 Meta-analysis 方法進行分析后認為:食管鱗癌血清miRNAs可以作為一種新的微創、具有優越診斷特性的生物標志物。相比于唾液miRNAs，血楽/血清miRNAs具有更好的診斷特性(Wang YY等，Identificat1n ofmicroRNAs as novel b1markers for detecting esophageal squamous cell carcinomain Asians: a meta-analysis.Tumor B1l, 2014, 35(11): 11596-11604)。
[0007]血清miRNAs的主要檢測方法有:芯片技術、qPCR、Northern雜交、原位雜交、高通量測序等。當用低密度、Solexa、美國昂飛、安捷倫、Toray 3D_Gene microRNA高通量檢測食管鱗癌的血清/血漿miRNA表達譜時，所檢測到的miRNAs的差異數量從11-219個不等，而且重復率極低。不同實驗室用相同的芯片技術或同一實驗室用不同的芯片技術檢測時，miRNAs表達差異數量不大，但種類差異較大。而最常用的檢測方法是qPCR檢測。雖然大多數課題組選擇使用TaqMan探針檢測血清miRNA的表達水平，但無可爭議的事實是探針價格昂貴，單個miRNA的探針價格為1000元(150uL)只能檢測40多個樣本，因此，需要尋找經濟、高效和特異的方法檢測食管鱗癌相關的血清miRNAs，為相應的與食管鱗癌相關miRNAs的表達情況的檢測以及食管鱗癌的檢測提供有效途徑，將有助于食管鱗癌的早期篩查與診斷。
[0008]綜上所述，本領域采用莖環引物qPCR技術檢測血清中食管鱗癌的基因標志物miRNAs基因很少，因此可開發該技術應用于食管鱗癌的早期診斷中。
【發明內容】
[0009]本發明解決的技術問題是提供了一種用于檢測食管鱗癌相關血清miRNAs基因的試劑盒。
[0010]本發明為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種用于檢測食管鱗癌相關血清miRNAs基因的試劑盒，其特征在于包含有用于診斷食管鱗癌相關血清miRNAs基因的莖環引物與RNase-free水配制的檢測試劑，其中食管鱗癌相關血清miRNAs基因是hsa-miR-10a_5p 基因、hsa-miR-16_5p 基因、hsa-miR-18a_5p 基因、hsa-miR-21_5p 基因、hsa-miR-22_3p 基因、hsa-miR-25_3p 基因、hsa-miR-31_5p 基因、hsa-miR-100_5p 基因、hsa-miR-107 基因、hsa-miR-127_3p 基因、hsa-miR-129_5p 基因、hsa-miR-148b_3p 基因、hsa-miR-155_5p 基因、hsa-miR-194_5p 基因、hsa-miR-200c_