Bst DNA聚合酶在RNA擴增中的應用
【專利說明】
【背景技術】
[0001]RNA是基因組中遺傳信息表達的核心和關鍵，也是生命科學研究的重要對象，對RNA研究的目的、技術手段等雖然各不相同，但獲取足夠的量進行后續研究卻是共同的要求。隨著許多先進實驗儀器設備以及技術方法的應用，RNA的擴增手段越來越多，但生物醫學、檢驗檢疫等方面對RNA的快速擴增提出了更高的要求，使之更滿足現場檢測的需要。
[0002]RNA擴增是以RNA為模板，反轉錄為cDNA，再在cDNA的基礎上進行擴增。目前，擴增RNA的常用方法有反轉錄PCR(RT-PCR)，滾環擴增(RCA)、依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)、指數鏈置換技術(exponential SDA)、改良的侵入擴增反應(modified invaderamplificat1n)、發夾介導的二次酶擴增和環介導等溫擴增(LAMP)等，但這些方法大多涉及反轉錄過程，即引物在反轉錄酶(AMV、MMLV等)的作用下以RNA為模板產生cDNA鏈，這也是目前RNA擴增最關鍵的一步。
[0003]現有的RNA檢測實驗存在反轉錄和后續擴增兩個步驟，以RT-PCR為例，提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用反轉錄酶反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。
[0004]反轉錄酶的最佳反應條件為42°C保溫60min，而42°C時，RNA的二級結構難以被打開，需要先在70°C保溫5min后立即冰浴，再進行反轉錄操作，第二步以反轉錄cDNA為模板的擴增實驗所用的酶也有溫度要求，兩者難以進行溫度的統一，得到在同一溫度下反應的最佳檢測條件。因此現有的RNA擴增檢測方法存在反應時間長、操作步驟復雜等限制，無法滿足RNA快速檢測的需求。
[0005]Bst DNA聚合酶大片段是BaciIIus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有Y -3r DNA聚合酶活性，但缺失5 ^ — 3 ^核酸外切酶活性。Bst DNA聚合酶大片段最主要的特性是具有超強的鏈置換功能(strand displacement)，可用于要求嗜溫鏈置換的等溫擴增實驗，富含GC區域的DNA測序，納克級含量DNA模板的快速測序。需要注意的是，此酶建議反應溫度不要超過70°C，不能用于熱循環測序或PCR。長期貯存需加入100 μ g/mlBSA 或 0.1% Triton X-1OO0
[0006]Bst 2.0 DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶，大片段的同源物，并由電腦模擬設計完成。Bst 2.0 DNA聚合酶具有Y - 3r的聚合酶活性和強鏈置換活性，但沒有Y - 3r核酸外切酶活性。和野生型Bst DNA聚合酶，大片段相比，該酶可有效提高擴增速度、產量、耐鹽性和熱穩定性等。來源于E.coli菌株，該菌株攜帶有誘導啟動子，可表達Bst 2.0 DNA聚合酶蛋白。
[0007]Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶在等溫聚合酶中是獨有的。像“熱啟動”PCR聚合酶一樣，這種特性在低于最適反應溫度下可以抑制酶活性。因此，實驗操作可以在室溫下進行而不至于引發非特異性反應。
[0008]單位定義:65°C條件下，30分鐘內使1nmol的dNTP摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定義為I個活性單位。
[0009]活性檢測條件:50mMKCl, 20mM Tris-HCl (pH 8.8)，10mM MgCl2,30nMM13mpl8ssDNA, 70nM M13 測序引物(-47)24mer, 200 μ M dATP, 200 μ M dCTP, 200 μ MdGTP, 100 μ M[3H] dTTP, 100 μ g/ml BSA 和酶，65°C溫育。Bst DNA 聚合酶除了其最佳緩沖溶液外，根據后續擴增實驗需要的其他緩沖溶液也有一定的活性，例如NEBufTer3.1。
[0010]貯存條件:50mMKCl, 1mM Tris-HCl (pH 7.5)，ImM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1 %Triton X-1OO 和 50%甘油。貯存于 _20°C。
[0011]熱失活:80°C，20min。
[0012]Bst DNA 聚合酶包括 Bst DNA 聚合酶大片段(Bst large fragment DNApolymerase)，Bst 2.0 DNA 聚合酶(Bst 2.0 DNA polymerase)，Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase)
[0013]Bst DNA聚合酶還包括Bst DNA聚合酶大片段為主體突變而成的新酶，或與其他配體結合成的新酶，其催化主體為Bst DNA聚合酶大片段。以下統一簡稱為Bst DNA聚合酶。
【發明內容】
[0014]本發明針對現有RNA擴增檢測技術上的不足，以新發現的Bst DNA聚合酶可以反轉錄RNA的特性，提出了對RNA擴增的新應用，解決現有RNA擴增技術中反轉錄反應和后續擴增反應過程復雜，時間長，成本高的問題。
[0015]Bst DNA聚合酶在RNA擴增中的應用，所述Bst DNA聚合酶具有反轉錄酶活性，使RNA在其作用下反轉錄為cDNA。
[0016]所述Bst DNA聚合酶具備反轉錄功能時的最佳反應條件為:1X等溫擴增緩沖液[20mM Tris-HCl(pH 8.8i25°C )，50mM KCl，1mM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4,0.1% Tween-20],據后續擴增實驗其他酶的需要，也可以選擇其他的緩沖溶液，如NEBuffer3.1。
[0017]所述Bst DNA聚合酶具有反轉錄活性時的適宜溫度為55-72 °C，優選的55?65 °C。
[0018]反轉錄的模板RNA長度為:小于262nt，優選的50_125nt。
[0019]根據所述Bst DNA聚合酶的反轉錄活性，RNA擴增的方法，步驟如下:
[0020](I)、以目標RNA為模板，加入Bst DNA聚合酶，反轉錄合成cDNA ;進一步的，所述反轉錄合成溫度為55?65°C，所述Bst DNA聚合酶加入量為反應體系的1/200。
[0021 ] (2)、以步驟I所得的cDNA為模板，加入DNA聚合酶，擴增cDNA的數量以實現目標RNA的擴增。
[0022]進一步的，所述RNA擴增的方法為等溫擴增，步驟如下:
[0023](I)、以目標RNA為模板，加入Bst DNA聚合酶，反轉錄合成cDNA ;進一步的，所述反轉錄合成溫度為55?65°C，所述Bst DNA聚合酶加入量為反應體系的1/200。
[0024](2)、以步驟I所得的cDNA為模板，加入Bst DNA聚合酶，擴增cDNA的數量以實現目標RNA的擴增。
[0025]所述等溫擴增時IX NEBuffer3.1 為 10mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 1mMMgC12, 100 μ g/ml BSA(pH 7.9@25°C )。根據具體擴增實驗，緩沖溶液也可以為NEBuffer 1，NEBuffer 2，等溫緩沖溶液等。
[0026]所述方法根據Bst DNA聚合酶兼具反轉錄活性與聚合酶活性，直接在RNA革E標上進行鏈置換擴增，使得整個體系完全在等溫條件下一步進行，無需反轉錄酶的加入，使反轉錄與擴增實現一體化，減少了酶的用量，且縮短了反應時間。
[0027]有益效果:
[0028](I)本發明以Bst DNA聚合酶具有反轉錄酶活性這一新發現為基礎，構建了新的RNA擴增檢測新方法，所述方法將反轉錄與后續核酸擴增融為一體，全過程無需對溫度進行調節，不需要添加額外的反轉錄酶，操作簡單，縮短反應時間，為RNA反轉錄及擴增檢測提供了新的方法學參考和技術支持。
[0029](2)發現的Bst DNA聚合酶可以在較高的溫度下進行反轉錄反應，這有助于打開和結合具有復雜二級結構的RNA，從而解決了 AMV等反轉錄酶難以擴增RNA高級結構區域的問題。
【附圖說明】
[0030]圖1非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳反轉錄驗證圖
[0031]其中，泳道M:20bp DNA Marker ;泳道 1:750nM 的 RNA 模板；泳道 2:750nM 的 RNA模板，750nM的反轉錄引物；泳道3 =AMV反轉錄酶參與的反轉錄擴增反應；泳道4:Bst DNA聚合酶大片段參與的反轉錄擴增反應
[0032]圖2 HCV - RNA (50nt) RT-PCR 結果圖
[0033]其中，曲線1:Bst 2.0 DNA聚合酶參與的RT-PCR反應；曲線2:Bst 2.0ffarmStartDNA聚合酶參與的RT-PCR反應；曲線3:Bst DNA聚合酶大片段參與的RT-PCR反應；曲線4:AMV反轉錄酶參與的RT-PCR反應；曲線5 =Blank (即以水為模板進行的PCR)
[0034]圖3 大腸桿菌(K-12) 16S rRNA (65nt) RT-PCR 結果圖
[0035]其中，曲線1:Bst 2.0 DNA聚合酶參與的RT-PCR反應；曲線2:Bst 2.0ffarmStartDNA聚合酶參與的RT-PCR反應；曲線3:Bst DNA聚合酶大片段參與的RT-PCR反應；曲線4:AMV反轉錄酶參與的RT-PCR反應；曲線5 =Blank (即以水為模板進行的PCR)
[0036]圖4 大腸桿菌(K-12) 16S rRNA (125nt) RT-PCR 結果圖
[0037]其中，曲線1:Bst 2.0 DNA聚合酶參與的RT-PCR反應；曲線2:Bst 2.0ffarmStartDNA聚合酶參與的RT-PCR反應；曲線3:Bst DNA聚合酶大片段參與的RT-PCR反應；曲線4:AMV反轉錄酶參與的RT-PCR反應；曲線5 =Blank (即以水為模板進行的PCR)
[0038]圖5 大腸桿菌(K-12) 16S rRNA (262nt) RT-PCR 結果圖
[0039]其中，曲線1:Bst 2.0 DNA聚合酶參與的RT-PCR反應；曲線2:Bst 2.0ffarmStartDNA聚合酶參與的RT-PCR反應；曲線3:Bst DNA聚合酶大片段參與的RT-PCR反應；曲線4:AMV反轉錄酶參與的RT-PCR反應；曲線5 =Blank (即以水為模板進行的PCR)
[0040]圖6大腸桿菌(K-12) 16S rRNA不同長度RT-PCR結果圖
[0041]其中，泳道M:20 bp DNA Marker ;泳道1:AMV反轉錄酶參與的模板為65nt的RT-PCR ;泳道2:Bst DNA聚合酶，大片段參與的模板為65nt的RT-PCR ;泳道3 =AMV反轉錄酶參與的模板為125nt的RT-PCR ;泳道4:Bst DNA聚合酶，大片段參與的模板為125nt的RT-PCR ;泳道5 =AMV反轉錄酶參與的模板為262nt的RT-PCR ;泳道6:Bst DNA聚合酶，大片段參與的模板為262nt的RT-PCR ;泳道7:以水模板進行PCR
[0042]圖7.不同濃度cDNA熒光信號，由Bst 2.0聚合酶反轉錄得到的cDNA稀釋不同濃度進行實時熒光定量RCR的結果圖
[0043]其中，曲線1:1.0pmol cDNA作為模板進行PCR ;曲線2:100fmol cDNA作為模板進行PCR ;曲線3:1Ofmol cDNA作為模板進行PCR ;曲線4:1.0fmol cDNA作為模板進行P