一種纖維二糖水解酶突變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于酶工程技術領域，具體涉及一種纖維二糖水解酶突變體及其在木質纖 維素降解中的應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素酶（Cellulases)是水解纖維素（β-1，4葡聚糖或者β-D-糖苷鍵）導致 形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖（cellooligosaccharides)和類似物質的酶。纖維素酶在 傳統上已被分為三個主要類型：內切葡聚糖酶（endoglucanases，EC 3. 2. 1. 4)，外切葡聚 糖酶（exoglucanases)或者纖維二糖水解酶（cellobiohydrolase，EC 3.2. 1.91)和 β-葡 萄糖苷酶（β-D-glucoside glucohydrolase，EC 3. 2. 1.21)。內切葡聚糖酶主要作用于纖 維素纖維的非晶體部分，而外切葡聚糖酶纖維二糖水解酶是唯一可以作用于晶體纖維素的 酶組分。因此，纖維二糖水解酶在纖維素酶體系中的存在對于晶體纖維素的有效溶解是必 需的。
[0003] 纖維二糖水解酶由3個部分組成：具有催化活性的催化結構域，作用為錨定纖維 素的纖維素結合域以及連接這兩個結構域的一段短肽。在水解纖維素過程中，纖維二糖水 解酶主要作用于纖維素線性分子非還原端，水解β -1，4-糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖 分子，使結晶纖維素成為易溶解的非結晶纖維素。
[0004] 當前經濟過分依賴于石油、煤炭等化石燃料，其不可再生性導致資源逐漸枯竭，燃 燒產生的二氧化碳已造成氣候環境的日益惡化。尋找可再生的清潔能源成為各國科研人員 關注的焦點。其中生物質能源因具有來源廣泛、價格低廉、再生性強等優點，成為最具潛力 的能源物質。生物乙醇是源于可再生物質的重要能源之一。木質纖維素是地球上最豐富的 可再生資源，全球每年通過光合作用產生的植物約10000億噸，為避免與人爭糧，木質纖維 素將成為生物乙醇生產最具潛力的原料。
[0005] 木質纖維素煉制生物乙醇過程通常包括預處理、水解、發酵、蒸餾等單元操作，其 中纖維素水解為可發酵糖是纖維素乙醇煉制過程中至關重要的環節。目前，木質纖維素的 降解主要有化學法和酶法水解。與化學法水解相比，酶法水解工藝條件溫和，設備簡單，能 耗低，同時具有副產物少、環境友好等特點，受到廣泛重視并取得重大進展。
[0006] 由于木質纖維素中的纖維素主要以結晶狀態存在，因此纖維二糖水解酶在木質纖 維素水解中的作用相當重要。但目前現有的纖維二糖水解酶活力低，耗酶量大，發酵成本 高，且其在酸性條件下的酶解效率和轉化率普遍偏低，嚴重限制了木質纖維素在生物乙醇 生產中的應用。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種纖維二糖水解酶突變體及其在木質纖維素降解中的應 用。本發明通過對纖維二糖水解酶進行蛋白質工程改造，獲得了突變體蛋白。所述突變體 在酸性條件下的酶活力得到顯著提高，且耐熱性更強，能大大提高木質纖維素的降解效率， 進而促進其在生物乙醇生產中的應用。
[0008] 本發明一方面提供了一種纖維二糖水解酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO: 1 的纖維二糖水解酶第33位氨基酸由Gln變為Lys，第91位氨基酸由Ala變為Lys，第105位 氨基酸由Glu變為Ala，第112位氨基酸由Ala變為Thr，第224位氨基酸由Asp變為Asn。
[0009] 上述纖維二糖水解酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其編碼基因的核酸序 列為 SEQ ID NO :4。
[0010] 本發明另一方面提供了一種重組質粒，其攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :4的纖維 二糖水解酶突變體的基因。
[0011] 本發明還提供了一種重組菌株，是通過將上述重組質粒轉化入里氏木霉 (Trichoderma reesei)中獲得的。
[0012] 本發明還提供了上述纖維二糖水解酶突變體在生物乙醇生產中的應用。
[0013] 本發明提供的纖維二糖水解酶突變體比野生型的耐酸性更強，其最適pH為5. 0， 且在pH4. 0-7. 0范圍內均能保持65%以上的酶活水平，而野生型的最適pH為5. 5。所述纖 維二糖水解酶突變體可廣泛應用于木質纖維素的降解，能顯著提高木質纖維素的糖化率。 其中，添加本發明所述纖維二糖水解酶突變體MAF7A的實驗組2中木質纖維素的糖化率比 對照組提高了 9. 5%，比添加野生型纖維二糖水解酶AF7A的實驗組1提高了 3. 5%，取得了 意料不到的技術效果。
【附圖說明】
[0014] 圖1為重組菌株發酵上清液SDS-PAGE電泳檢測分析圖，其中，泳道1為里氏木霉 工程菌AF7A發酵上清液，泳道2為里氏木霉工程菌MAF7A發酵上清液，泳道3為對照組宿 主菌里氏木霉SCHD4發酵上清液，泳道1和2中箭頭所指70kDa處的蛋白條帶分別為重組 表達的纖維二糖水解酶AF7A和突變體MAF7A ;
[0015] 圖2為纖維二糖水解酶突變體與野生型pH-相對酶活曲線圖。
【具體實施方式】
[0016] 本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是本發明不限定于所述的任何具體方法、實 驗方案和試劑。
[0017] 下面結合具體的實施方式對本發明進行詳細描述。
[0018] 實施例1 :纖維二糖水解酶突變體基因的篩選
[0019] 為了提高野生型纖維二糖水解酶AF7A(氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，編碼核苷酸序 列為SEQ ID NO :2,由上海生工生物工程股份有限公司合成）在酸性條件下的酶活力，通過 定向進化技術對該酶進行了大量突變的篩選，設計PCR引物AF7A-FUAF7A-R1如下：
[0020] AF7A-F1 ：GGCGAATTCATGATGCTGGCCTCCACCTTCTCC (下劃線為限制性內切酶 EcoRI 識別位點）；
[0021] AF7A-R1 :ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGAGAGTAATAATC (下劃線為限制性內切酶 NotI 識別位點）；
[0022] 以野生型纖維二糖水解酶AF7A基因 SEQ ID N0:2為模板，利用上述引物用 GeneMorph II隨機突變PCR試劑盒（Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產物，EcoR I、 Not I進行酶切處理后與經同樣酶切后的pET21a載體連接，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中， 涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培養，待轉化子出現后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個孔中加 入150 μ L含有0.1 mM IPTG的LB+Amp培養基，37°C，220rpm培養6h左右，離心棄上清，菌體 用緩沖液重懸，反復凍融破壁，獲得含有纖維二糖水解酶的大腸桿菌細胞裂解液。
[0023] 各取50 μ L裂解液至兩塊新的96孔板，分別在pH6. 0和pH4. 0的條件下測定其纖 維二糖水解酶酶活。結果發現，有些突變子在酸性條件的酶活沒有變化，有些突變子的酶 活甚至降低了，對在pH4. 0條件下依然保持高酶活的突變子進行DNA測序，最終，申請人獲 得了能顯著提高纖維二糖水解酶酸性耐受性的突變位點組合Q33K、Α91Κ、Ε105Α、Α112Τ和 D224N。
[0024] 將含Q33K、Α91Κ、Ε105Α、Α112Τ和D224N突變位點的纖維二糖水解酶突變體命名 為MAF7A，其氨基酸序列為SEQ ID NO :3,編碼核苷酸序列為SEQ ID NOM13SEQ ID NO :4由 上海生工生物工程股份有限公司合成，并且在合成序列5'和3'兩端分別加上KpnI和XbaI 兩個酶切位點。
[0025] 將合成后的基因片段用限制性內切酶KpnI和XbaI (Fermentas)進行酶切；同時， 用限制性內切酶KpnI和XbaI對載體pTG進行酶切；凝膠回收目的基因片段和載體；并用 T4 DNA連接酶將上述兩片段連接，轉化Trans5a大腸桿菌，用氨芐青霉素進行篩選。為確 保準確，對若干克隆進行測序（Invitrogen)。
[0026] 使用質粒中量制備試劑盒（Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質 粒，將攜帶纖維二糖水解酶突變體基因序列的重組表達質粒命名為PTG-MAF7A。
[0027] 實施例2 :纖維二糖水解酶突變體重組菌株的構建及驗證
[0028] (1)原生質體制備
[0029] 取里氏木霉（Trichoderma reesei) SCHD4菌株孢子懸液，接種于PDA平板上，30°C 培養6天；待其產孢豐富后，切取約IcmX Icm的菌落置于含120mL YEG+U (0. 5%酵母粉、1 % 葡萄糖、0. 1%尿苷）的液體培養基中，30°C，220rpm振蕩培養14~16h ;
[0030] 用無菌紗布過濾收集菌絲體，并用無菌水清洗一次；將菌絲體置于含有20mL 10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412)的三角瓶中，30°C，90rpm作用1-2h;用顯微鏡觀察檢測 原生質體轉化進展；
[0031] 將預冷的20mL I. 2M山梨醇（I. 2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述 三角瓶中，輕輕搖勾，用無菌Miracloth濾布過濾收集濾液，3000rpm，4°C離心10min ;棄上 清，加入預冷的5mL I. 2M山梨醇溶液懸浮菌體，3000rpm，4°C離心10min ;棄上清，加入適量 預冷的I. 2M山梨醇懸浮分裝（200 μ L/管，原生質體濃度為IO8個/mL)。
[0032] (2)表達載體轉化與菌株驗證
[0033] 以下操作均在冰上進行，取10 μ g重組質粒pTG-MAF7A加入到含有200 μ L原生 質體溶液的7