乳液體系固定化脂肪酶及方法
【技術領域】
[0001] 本發明創造屬于催化劑制備技術領域，涉及一種在傳統固定化酶的基礎上，通過 構建Pickering乳液體系提高酶在兩相反應中的催化性能的方法。
【背景技術】
[0002] 酶作為高效催化劑廣泛的應用于各種有機反應，為工業生產提供了眾多必不可少 的中間體。然后游離酶的結構容易受到外界環境的影響，從而影響了催化反應的活性及重 復利用過程中的穩定性。酶的固定化技術能夠有效改善這個情況，反應完成后經過簡單的 過濾或離心，酶就可以回收，而且酶活力降低較少，這樣就降低了生產成本；而且固定化體 系適合于連續化、自動化生產，催化過程容易控制，且產品中不會帶進酶蛋白或細胞，改善 了后處理過程，提高了酶的利用效率，降低了生產成本。
[0003] Yin等人將脂肪酶通過交聯法固定在硅鎂土上并催化生物柴油合成，反應24h 后產物產率達94%，催化劑重復利用10次后還保持有95 %的相對活性（Biodiesel production from jatropha oil catalyzed by immobilized Burkholderia cepacia lipase on modified attapulgite，Bioresour.Technol·，2013,148, 202 - 207)。盡管實現 了固定化的初衷，但并沒有考慮固定化過程對脂肪酶產生的抑制作用，該催化劑還有很大 的提升空間。
[0004] Mohammadi等人向載體SBA-15中通過嫁接烷基基團改性后，再利用共價法固 定化脂肪酶，將其用于催化合成生物柴油過程中展現了良好的穩定性和催化活性，而且 重復利用次數也得到 了增加 （Rapid and high-density covalent immobilization of Rhizomucor miehei lipase using a multi component reaction:application in biodiesel production，RSC Adv.，2015, 5, 326-398)。但是在實際應用中很多反應都需要 兩相條件，限制了酶的應用范圍：生物酶大多是水溶性的，底物則往往只溶于有機溶劑，為 了促進反應進行保證足夠的傳質必然需要將體系混合，而酶如果長時間暴露在有機溶劑和 處于攪拌狀態中又會因為變性而失活，無法充分有效的催化反應進行。
【發明內容】
[0005] 本發明創造為解決現有技術中的問題，提供了一種乳液體系固定化脂肪酶，解決 了現有技術中存在的固定化酶不利于催化雙水相反應的問題。所得Pickering乳液體系固 定化脂肪酶的含酶周期性介孔娃（periodic mesoporous organosilicas，PM0)顆粒位于有 機溶劑-水的界面處，呈現一種穩定的狀態，滿足連續催化兩相反應的需要。
[0006] 本發明創造提供的乳液體系固定化脂肪酶，通過包括下述的步驟獲得：以特定有 機硅為前驅體制備PMO顆粒，并將酶固定在PMO顆粒內，獲得含酶PMO顆粒，命名為LP0PM0 ; 然后將LP0PM0置于特定有機溶劑與磷酸緩沖液的混合液中，均質乳化后得到本發明穩定 的乳液體系固定化脂肪酶，命名為LPOPE ;其中，所述特定有機硅與特定有機溶劑對應關系 為下述之一：
[0007] (1)當特定有機硅具有式I的結構時，其中，R為烷基或烯基的疏水性基團，特定有 機溶劑采用極性在1. 0-3. 2、與水不互溶的有機溶劑；
[0009] ⑵當特定有機硅為二（3-(三乙氧基硅基）丙基）二硫或正硅酸烷基酯時，特定 有機溶劑采用極性在〇. 1-1. 〇、與水不互溶的有機溶劑；
[0010] (3)當特定有機硅為聚烷基倍半硅氧烷時，特定有機溶劑采用極性在3. 4-4. 5、與 水不互溶的有機溶劑。
[0011] 其中，對于上述第（1)組對應關系，所述具有式I的結構的有機硅中，R優選為 C1-C5的烷基SC2-C5的烯基；更優選的選自1，2-二（三乙氧基硅基）乙烷、1，2-二（三乙 氧基硅基）甲烷或1，2-二（三乙氧基硅基）乙烯；所述特定有機溶劑為甲苯或四氯化碳。
[0012] 其中，對于上述第（2)組對應關系，所述特定有機硅優選為正硅酸甲酯或正硅酸 乙酯，所述特定有機溶劑為庚烷或正己烷。
[0013] 其中，對于上述第（3)組對應關系，所述聚烷基倍半硅氧烷優選為聚C1-C 5的烷基 倍半硅氧烷，更優選為聚戊基倍半硅氧烷；所述特定有機溶劑為乙酸乙酯。
[0014] 其中，所述LPOPMO與特定有機溶劑和磷酸緩沖液的混合不受順序限制，可以先將 LPOPMO置于特定有機溶劑中，再加入磷酸緩沖液，也可以先將特定有機溶劑和磷酸緩沖液 混合，再向其中加入LPOPMO。
[0015] 進一步，所述含酶PMO顆粒LPOPMO的制備過程包括，以特定有機硅為前驅體、聚環 氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷三嵌段共聚物為模板劑、均三甲苯（TMB)為擴孔劑制備 PMO顆粒，并利用吸附法將酶固定在PMO顆粒內。
[0016] 其中，所述擴孔劑與模板劑的質量用量比為1:1-3:1，可以得到孔徑大小與酶分子 尺寸相適宜的PMO顆粒，從而使得酶的穩定性得到提升。
[0017] 其中，所述聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷三嵌段共聚物優選為 P123 Φ〇2〇Ρ07〇Ε02。）或 F127 Φ〇1()6Ρ07〇Ε0106)。
[0018] 進一步，所述磷酸緩沖液的pH為6. 0-8. 5,濃度為0· 45% -0· 95% v/v。
[0019] 進一步，所述均質乳化過程可采用超聲波振蕩器、細胞粉碎機、乳化器或漩渦振蕩 器進行。
[0020] 本發明創造構建的乳液體系固定化脂肪酶，首先通過設計一種孔結構和親疏水程 度適宜的有機硅載體實施酶的固定化，為脂肪酶提供一定的保護，同時利用適當的溶劑以 構建兩相酶催化劑，使得固定化后的含酶PMO顆粒位于油水兩相界面處，進一步提高該酶 的催化性能和穩定性。本發明提供的乳液體系固定化脂肪酶可保存150天以上或連續震 蕩400小時以上，同時重復利用過程中的回收操作簡單，靜置幾秒鐘就可以完成催化劑的 回收。采用本發明創造，對于非含硫前驅體制備的乳液體系固定化脂肪酶作為合成生物柴 油的催化劑，生物柴油得率可達90%以上，且重復利用10次以上的反應產物得率無明顯下 降，得率下降率不超過2% ;對于含硫前驅體制備的固定化脂肪酶，其首次生物柴油得率及 重復使用能力都得到了有效提高。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1是LPOPMO的形貌示意圖，其中，具有孔結構的球狀結構（灰色部分）為有機 硅結構，球狀圓點（白色部分）為脂肪酶；
[0022] 圖2是LPOPE的共聚焦顯微鏡圖，其中，圓圈狀（綠色）部分為羅丹明標記的LPO PMO顆粒，圓圈內部為水相，圓圈外部為有機溶劑；
[0023] 圖3是未凝膠的LPOPE形貌圖（a)及凝膠后的LPOPMO形貌圖（b)。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過結合附圖對本發明創造進行進一步說明。為敘述方便，具體實施過程中 略去了對一些公知的或常規的過程或手段的具體描述。
[0025] 實施例1
[0026] 以1，2-二（三乙氧基硅基）乙烷為硅前驅體，P123為模板劑，TMB為擴孔劑，且 TMB與P123質量用量比為2:1，合成周期性介孔硅PMO顆粒。利用吸附法將假絲酵母脂肪 酶固定在載體PMO顆粒內，命名為LPOPMO。稱取150mg LPOPMO顆粒至于5ml甲苯中，混合 振蕩Imin使顆粒均勻分散在甲苯溶劑中。加入0. 65% v/v磷酸緩沖液（pH 7. 0)后，利用 超聲波粉碎機對混合液乳化，操作條件為（45w)功率下超聲12s，每超聲2s間隔Is。制得 乳液體系固定化脂肪酶，命名為LPOPE。
[0027] 在25m