一種干細(xì)胞球切割收集裝置及干細(xì)胞球的切割分離傳代方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種干細(xì)胞球切割收集裝置及干細(xì)胞球的切割分離傳代方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞時，常常出現(xiàn)干細(xì)胞團塊或稱干細(xì)胞球，在長期培養(yǎng)中傳代都使用胰蛋白酶或胰蛋白酶加Η)ΤΑ的分離細(xì)胞球的方法分離傳代。由于長期使用這些酶的化學(xué)分離法對細(xì)胞膜受體產(chǎn)生不同程度的損傷，嚴(yán)重影響長期培養(yǎng)中干細(xì)胞的壽命。神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展是由于神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少或功能改變造成的。通過移植神經(jīng)干細(xì)胞可治療相關(guān)神經(jīng)退行性疾病。胚胎干細(xì)胞不但在作用機制等研究領(lǐng)域中起到很重要的作用，而且在多種疾病防治中也有極其重要的作用。培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞在研究腫瘤發(fā)生和防治中起到重要作用。所以一種快速簡便的、不損傷細(xì)胞的干細(xì)胞球分離法十分重要。
[0003]神經(jīng)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，在相關(guān)細(xì)胞因子刺激下，可在體外增殖并形成特殊的球狀結(jié)構(gòu)，此球狀結(jié)構(gòu)被稱為神經(jīng)球。神經(jīng)球具有特殊的微環(huán)境，可保持球內(nèi)干細(xì)胞的存活和增殖，并賦予神經(jīng)干細(xì)胞向外胚層細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)分化的潛能。神經(jīng)球的制備是神經(jīng)干細(xì)胞治療的關(guān)鍵步驟，它們的質(zhì)量直接影響到神經(jīng)干細(xì)胞臨床的治療療效。
[0004]目前常用的方法包括酶消化法或機械吹打法。酶消化法是利用單獨胰酶或胰酶與EDTA合用的方法消化神經(jīng)球。研究顯示酶消化法可導(dǎo)致干細(xì)胞發(fā)生突變，也存在操作時間長和細(xì)胞損傷大等缺點。機械吹打法采用滴管或移液管對組織進(jìn)行反復(fù)吹打，盡管操作時間短，但同樣對細(xì)胞損傷大。并且所得到的細(xì)胞團塊大小不均，導(dǎo)致部分神經(jīng)球體積過大，影響神經(jīng)干細(xì)胞的存活、生長和分化。最近有人用鋒利刀片切割法，這種方法比以前的方法有大的改進(jìn)，但是可以造成很多細(xì)胞碎片，這些碎片可能會影響干細(xì)胞的正常生長發(fā)育。因此，建立一種簡便、快速、無誘發(fā)基因突變、對細(xì)胞損傷較小以及可制備大小均勻的神經(jīng)球的制備方法，是目前亟待解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明為解決神經(jīng)干細(xì)胞傳代過程導(dǎo)致的神經(jīng)干細(xì)胞易發(fā)生細(xì)胞凋亡、突變、細(xì)胞損傷、神經(jīng)干細(xì)胞分化以及操作時間長和神經(jīng)球大小不均一等問題，提供一種干細(xì)胞球切割收集裝置。
[0006]本發(fā)明還提供利用上述裝置進(jìn)行的具有簡便、快速、無誘發(fā)基因突變、對細(xì)胞損傷較小的干細(xì)胞球的切割分離傳代方法。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種干細(xì)胞球切割收集裝置，該裝置包括干細(xì)胞球切割器、干細(xì)胞球收集瓶和具有正壓和負(fù)壓雙向抽氣功能的抽氣栗，干細(xì)胞球切割器和干細(xì)胞球收集瓶之間由管路連接，該干細(xì)胞球切割器具有一管體，管體內(nèi)固定兩個間隔設(shè)置的篩網(wǎng)。
[0008]作為優(yōu)選，所述的篩網(wǎng)為不銹鋼篩網(wǎng)，兩個篩網(wǎng)的孔徑分別為350±40 μπι和104±20μπι，孔徑較大的篩網(wǎng)靠近干細(xì)胞球收集瓶。作為優(yōu)選，兩個篩網(wǎng)之間的距離為20mm。進(jìn)一步的，兩個篩網(wǎng)的孔徑分別為350±10 μπι和104±5 μm，孔徑的大小控制對干細(xì)胞球的切割具有重要意義。
[0009]作為優(yōu)選，該裝置還包括空氣緩沖瓶、三通管、培養(yǎng)瓶和切割后小干細(xì)胞球收集瓶，抽氣栗與空氣緩沖瓶通過管路連接，空氣緩沖瓶與干細(xì)胞球收集瓶通過管路連接，培養(yǎng)瓶和干細(xì)胞球收集瓶通過管路分別與三通管的兩個接口相連，三通管的第三個接口與干細(xì)胞球切割器連接。該結(jié)構(gòu)用于干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
[0010]作為優(yōu)選，干細(xì)胞球切割器的出口端設(shè)有一個縮口的連接管。
[0011]—種干細(xì)胞球切割收集裝置，該裝置包括注射器和與注射器相連的干細(xì)胞球切割器，該干細(xì)胞球切割器具有一管體，管體內(nèi)固定兩個間隔設(shè)置的篩網(wǎng)。所述的篩網(wǎng)為不銹鋼篩網(wǎng)，兩個篩網(wǎng)的孔徑分別為350±40 μπι和104±20 μπι，孔徑較大的篩網(wǎng)靠近干細(xì)胞球收集瓶。
[0012]一種干細(xì)胞球的切割分離傳代方法，該方法包括如下步驟:a.采用所述的干細(xì)胞球切割收集裝置對干細(xì)胞球進(jìn)行切割分離:將含有干細(xì)胞的培養(yǎng)液吸入干細(xì)胞球收集瓶后，利用流體壓力使干細(xì)胞球經(jīng)細(xì)胞球切割器鈍性切割成小干細(xì)胞團塊，然后進(jìn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶內(nèi)預(yù)置細(xì)胞培養(yǎng)液；b.將a步驟獲得的含有小干細(xì)胞團塊的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)；c、分瓶培養(yǎng)時，每3-7天更換一次新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，每20-30天重復(fù)a步驟對干細(xì)胞球進(jìn)行切割分離。
[0013]作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞球為神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞球的直徑達(dá)到500-2000 μπι大小時用干細(xì)胞球切割收集裝置將每一個神經(jīng)干細(xì)胞球切割成3-8小塊，進(jìn)行1:2、1:4或1:6分瓶傳代培養(yǎng)。
[0014]常規(guī)方法培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(神經(jīng)球)時，用胰蛋白酶或其它膠原酶把神經(jīng)球消化成單個細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。每I至2周傳代培養(yǎng)一次，隨著傳代次數(shù)增加，培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量逐漸減少(即緩慢死亡)。常規(guī)“胰蛋白酶消化”方法或用“胰蛋白酶+乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)消化”法或膠原酶消化法都很難把神經(jīng)干細(xì)胞(神經(jīng)球)傳代培養(yǎng)超越三個月。分析原因如下:1.胰蛋白酶能夠解離和破壞每個細(xì)胞之間的連接和輕微損傷細(xì)胞膜受體，在細(xì)胞內(nèi)可以切去C端肽段，可特異性地水解蛋白精氨酸、賴氨酸殘基右側(cè)肽健等作用。如果少量使用或一次使用胰蛋白酶對細(xì)胞生長的危害較小，對子代細(xì)胞甚至幾乎沒有明顯影響，因為細(xì)胞自身修復(fù)系統(tǒng)起作用。但如果多次使用胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，造成細(xì)胞的損害已經(jīng)超出細(xì)胞自身修復(fù)系統(tǒng)的能力，所以培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量逐漸減少；2.用胰蛋白酶把神經(jīng)球消化成單個細(xì)胞后，又需要用血清阻止胰蛋白酶的活性，而血清中含有很多促細(xì)胞分化因子，所以，按傳統(tǒng)方法培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞時，經(jīng)常遇到大量神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)，分化后的神經(jīng)元在體外培養(yǎng)后自然老化死去，因為神經(jīng)元是終末細(xì)胞，它無細(xì)胞分裂功能。即使分化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能夠分裂成子細(xì)胞而存活下去，但是在一般條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞不可能逆向分化成神經(jīng)干細(xì)胞，更沒有神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的功能。所以按常規(guī)方法無法長期培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。
[0015]用酶消化分離細(xì)胞法是對每一個細(xì)胞都會產(chǎn)生或多或少的影響，而本發(fā)明的“細(xì)胞球切割刀”分離干細(xì)胞球法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，對極大部分細(xì)胞是無任何損害的，但是對機械刀切割到的極小部分細(xì)胞是有損害或致命的，這極小部分致命的細(xì)胞自行死去，并隨著新舊培養(yǎng)液更換，隨著舊培養(yǎng)液而廢除。這對傳代后的新干細(xì)胞無明顯影響。因此，細(xì)胞球切割刀分離干細(xì)胞球法是培養(yǎng)干細(xì)胞的好方法，也是本發(fā)明在體外長期培養(yǎng)擴增干細(xì)胞方法的關(guān)鍵因素之一。
[0016]本發(fā)明解決了體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞易分化和易死亡的技術(shù)難題，達(dá)到長期培養(yǎng)擴增人神經(jīng)干細(xì)胞的目的，而且人神經(jīng)干細(xì)胞的特性穩(wěn)定，質(zhì)量可控，為廣泛應(yīng)用于臨床提供重要的、用之不竭的神經(jīng)干細(xì)胞資源。本發(fā)明人根據(jù)此法已經(jīng)對神經(jīng)干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)3年多時間。本發(fā)明中干細(xì)胞球切割收集裝置可以用于任何細(xì)胞球的切割分離傳代培養(yǎng)實驗研究和規(guī)?；a(chǎn)中。
【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明干細(xì)胞球切割收集裝置吸入干細(xì)胞球時的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是本發(fā)明干細(xì)胞球切割器的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是本發(fā)明干細(xì)胞球切割收集裝置切割神經(jīng)球時的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4是本發(fā)明干細(xì)胞球切割收集裝置的另一種結(jié)構(gòu)示意圖；
圖5為切割前的神經(jīng)干細(xì)胞球的顯微照片，
圖6為神經(jīng)干細(xì)胞球切割成小塊的顯微照片，
圖7為顯微鏡放大400倍的單個神經(jīng)干細(xì)胞和小團塊顯微照片；
圖8為神經(jīng)干細(xì)胞球切割后培養(yǎng)30天顯微照片；
圖中:1、抽氣栗，2、空氣緩沖瓶，3、干細(xì)胞球收集瓶，4、三通管，分離管路，5、培養(yǎng)瓶，6、干細(xì)胞球切割器，7、篩網(wǎng)，8、