Sem單克隆抗體的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫學技術領域，具體地，涉及一種SEM單克隆抗體的制備方法及應 用。
【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，簡稱SEs)，是由金黃色 葡萄球菌產生，能引起人類食物中毒、嘔吐腹瀉、休克的重要致病因子。目前已發現的腸毒 素有23種血清型，SEM屬于新型腸毒素，其理論分子量為24. 842KD。據文獻報道，sem基因 往往以基因簇（egc)的形式存在。因此，含有SEM的食品原料往往含有其他腸毒素。因此， 利用SEM單克隆抗體建立SEM免疫學檢測法，對控制金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食源性 疾病具有重大意義。
[0003] 傳統免疫動物方法制備抗體的效率低，產量有限，并且其產生的血清多克隆抗體 為多種抗體的混合物，其與抗原反應的特異性不高，重復性低。而單克隆抗體理化性狀高度 均一，生物活性單一，與抗原結合的特異性強，便于人為處理和質量控制，是免疫學領域的 重大突破。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提一種SM單克隆抗體的制備方法，通過該方法所 制備的SEM單克隆抗體效價高、性質穩定、特異性強。
[0005] 此外，本發明還提供一種SEM單克隆抗體的應用。
[0006] 本發明解決上述問題所采用的技術方案是：SEM單克隆抗體的制備方法，包括以 下步驟：以重組SEM免疫BALB/c小鼠，再用小鼠的脾細胞直接與骨髓瘤細胞融合，采用間接 酶聯免疫吸附法篩選產SEM單克隆抗體的優勢雜交瘤細胞株，得到SEM單克隆抗體。
[0007] SEM具體是指金黃色葡萄球菌新型腸毒素M，SEM潛在威脅人類健康，因而我們需 要對SEM進行檢測，目前對于SEM蛋白的研究較少，但在暴發的大規模的食源性疾病中sem 基因的檢出率較高，目前檢測SEM的方法只有PCR方法，因此為了快速檢測食品原料中SEM， 必須制備SEM單克隆抗體，利用抗SEM單克隆抗體構建SEM免疫學檢測法，從而達到快速檢 測的目的；本發明在制備SHM單克隆抗體的方法中，采用重組SHM作為免疫原，重組SHM具 有免疫原性，能夠直接激發免疫細胞產生特異性抗體，具有多個抗原決定簇，將其直接作為 免疫原作用于BALB/c小鼠制備單克隆抗體，可以同時制備出多種具有不同抗原決定簇的 單克隆抗體，可以用于構建雙單抗夾心ELISA檢測法。
[0008] 實驗證明，通過本發明所述方法制備的SEM單克隆抗體效價高、性質穩定、純度 高、特異性強、親和力高。
[0009] 進一步地，重組SEM的制備與純化過程為：以金黃色葡萄球菌的DNA為模板進行 PCR擴增，獲得sem基因完整片段，采用NdeI和XhoI分別酶切PCR產物和pET-28a (+)，連 接，篩選獲得重組質粒pET-28a-SEM，重組質粒pET-28a-SEM在表達場所內進行表達，表達 菌株進行培養、離心收集細胞菌體，再將細菌菌體超聲破碎，離心棄沉淀，上清進行過鎳瓊 脂糖親和層析、陽離子交換層析純化收集，進一步濃縮，獲得純化的SEM重組蛋白。所述sem 基因序列在 GenBank 中的 accession number 為 KT853047。
[0010] 目前，蛋白的合成主要包括人工合成多肽以及用現有DNA模板依次進行PCR擴增、 酶切、測序、質粒重組、重組質粒進行細胞表達得到細胞菌體，細胞菌體進行純化得到重組 蛋白，其中，通過人工合成的多肽分子量小，僅有一種抗原決定簇，因此由其制備的單克隆 抗體種類單一，并且人工合成的多肽為半抗原，由于半抗原缺乏免疫原性，不能直接激發免 疫細胞產生特異性抗體，因此，必須將半抗原與小鼠鑰孔蟲戚血藍蛋白（KLH)和牛血清蛋 白（BSA)偶聯作為免疫原才能得到特異性抗體，操作麻煩，本發明的SEM重組蛋白采用的 是以金黃色葡萄球菌的DNA為模板進行PCR擴增，獲得SEM的完整基因序列（accession number:KT853047);用NdeI和XhoI分別酶切PCR產物和pET-28a(+)、連接，篩選獲得重 組質粒pET-28a-SEM，通過本發明制備的SEM重組蛋白能直接激發免疫細胞產生特異性抗 體，并且可以同時制備出多種具有不同抗原決定簇的單克隆抗體，可以用于構建雙單抗夾 心ELISA檢測法。
[0011] 進一步地，重組的pET-28a-SEM質粒的表達場所為大腸桿菌。
[0012] 進一步地，優勢雜交瘤細胞株采用辛酸-飽和硫酸純化腹水，透析后得到SEM單克 隆抗體。本發明的純化抗體的方法操作簡單，不需特殊儀器，且蛋白損失小，純化效果較為 理想。
[0013] 進一步地，重組SEM與等量完全或不完全弗氏佐劑混合攪拌法將其乳化，乳化完 全后用于免疫BALB/c小鼠。
[0014] SEM單克隆抗體的應用，所述SEM單克隆抗體用于制備檢測樣品中含有SEM的試劑 條或試劑盒。
[0015] 綜上，本發明的有益效果是：
[0016] -般方法制備的單克隆抗體親和力僅能達到106,但通過本發明所述的方法制備 的SEM單克隆抗體親和力達10 8,說明本方法制備的SEM抗克隆抗體與抗原分子結合力更 強，可以大大提高構建SEM免疫學檢測法的靈敏度；此外本發明制備的SEM單克隆抗體還具 有效價高、性質穩定、純度高、特異性強等優點。因此，通過本發明所述的方法制備的SEM單 克隆抗體能夠應用于試劑條或試劑盒，能夠快速檢測出樣品中SEM的含量，能夠用于建立 SEM的免疫學檢測方法，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1是純化的融合蛋白SEM的SDS-PAGE分析圖；
[0018] 圖2是純化的融合蛋白SEM的WesternBlot分析圖；
[0019] 圖3是純化的融合蛋白SEM的灰度分析圖；圖3中Rf是色譜法中表示組分移動位 置的參數；
[0020] 圖4是純化的融合蛋白SEM濃度的BSA標準曲線；圖4中BSA是標準的結晶牛血 清蛋白Bovine Serum Albumin的縮寫；OD值是光密度Optical Density的縮寫，表示被檢 測物吸收掉的光密度；
[0021] 圖5是純化的SEM單克隆抗體的SDS-PAGE分析圖；
[0022] 圖6是SEM單克隆抗體親和常數分析圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合實施例及附圖，對發明作進一步地的詳細說明，但本發明的實施方式不 限于此。
[0024] 實施例1:
[0025] 一、SEM單克隆抗體的很制備：
[0026]I、SEM重組蛋白的制備及純化：
[0027] 1)菌株來源：采用保存的金黃色葡萄球菌（含sem基因，該基因序列已經提交到 GenBank數據庫中，該基因的登錄號為KT853047)。
[0028] 2)根據sem基因序列設計金黃色葡萄球菌新型腸毒素sem基因引物：
[0029]上游引物：CGTACGCATATGAAAAGAATACTTATCAITGT(NdeI);
[0030]下游引物：CGCTAGCTCGAGACTITCGTCCTTATAAG(Xho I)。
[0031] 3)質粒構建：以金黃色葡萄球菌的DNA為模板進行PCR擴增，獲得sem基因完整 片段，并連接.pMD:?19-TVector(Takara公司），進行測序。
[0032] 4)表達質粒的構建：NdeI (天根公司）和XhoI (天根公司）分別酶切PCR產物 和pET_28a(+)(天根公司），Solution I(Takara公司）16°C連接60min，轉入感受態細胞 DH5a (天根公司）中，37°C培養過夜，提取質粒，雙酶切鑒定，獲得重組質粒pET-28a-SEM。
[0033] 5)融合蛋白表達轉化：取I y L重組的pET-28a_SEM質粒轉入大腸桿菌 Rossetta(DE3)，42°C熱擊90s后冰上靜置5min加入700 y L培養基，37°C培養45min，取 IOOul 涂平板（30 y g/mL Kan)，37°C培養過夜。
[0034]6)小試培養選擇最佳的誘導條件
[0035] a.挑取表達菌株Rossetta (DE3) (pET_28a_SEM)的單菌落于試管中（4mL LB培養 基，30 y g/mL Kan) 37°C，220rpm 過夜培養。
[0036]b.將培養的菌液按1:100比例分別接種于4mL LB培養基中，添加至30 y g/mL Kan，37°C，220rpm 培養。
[0037] c?當OD值達到0?6左右時，分別添加終濃度為0?5mM的IPTG，220rpm，15°C過夜， 25°C過夜，37°C誘導5h，未加IPTG誘導劑的作為陰性對照。
[0038]d.收集菌體并用PBS緩沖液懸浮。
[0039] e. SDS-PAGE電泳檢測，選擇最佳的蛋白表達誘導條件。
[0040]7)大量誘導
[0041] 將培養的菌液按1:100比例接種于4L的LB液體培養基中，添加終濃度30 yg/mL Kan，37°C，220rpm培養，當OD值達到0? 6左右時，添加終濃度為0? 5mM IPTG，25°C，220rpm， 16h，離心收集細胞菌體。
[0042] 8)融合蛋白純化：將收集的細菌菌體用破碎Buffer(50mM Tris，300mM NaCl，7M 鹽酸胍，0.1 % Triton X-100, PH = 8. 0)溶解，冰浴中超聲破碎菌體，功率500W，20min (超 聲2s，暫停6s為一個循環）。超聲完畢后，12000rpm/min，4°C，離心20min，棄沉淀，上清做 下步純化。
[0043] 鎳瓊脂糖親和層析：取5mL mL Ni-IDA，用10倍柱床體積的Binding Buffer (50mM Tris，300mMNaCl，8M尿素，pH=8. 0)清洗平衡柱子，流速5mL/min。再將樣品（溶解液上 清）上柱，流速為2mL/min，收集穿透液。之后用10倍柱床體積的WashBuffer(50mMTris， 300mMNaCl，8M尿素，10/20/50mM咪唑，pH= 8.0)清洗柱子，流速2mL/min。再用Elution 811打61(5011111^18,3001111 似(：1，811尿素，5001111咪唑卬11 = 8.0)洗脫，流速211117111111，收集 洗脫液。最后將含目的蛋白的洗脫組分透析到25mMTris，4M尿素，PH= 8. 0的緩沖液中， 透析過夜，過濾分裝。
[0044] 最終得到的純化的SEM重組蛋白的SDS-PAGE分析見圖I;SEM免疫原的蛋白純度 分析見圖2,SEM蛋白純度為89. 3%;SEM蛋白濃度采用圖3的標曲進行計算，獲得的SEM蛋 白濃度為I. 8mg/ml。
[0045] 2、動物免疫：
[0046] 1)實驗動物：選5只6~8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。小鼠注射抗原前一周， 皮下注射Img卡介苗，以增強機體對抗原的免疫應答水平。
[0047] 2)抗原處理：將SEM免疫原與等量完全或不完全弗氏佐劑混合攪拌法將其乳化， 乳化完全后皮下多點注射小鼠。
[0048] 3)免疫方法：按照特定免疫流程（該免疫過程后老鼠達到了較高的效價，并且沒 有耐受）免疫小鼠，3免后用間接競爭法測定效價，效價達到要求后，進行沖刺免疫；沖免3 天后眼眶采血后進行融合。
[0049] 4)骨髓瘤細胞（Sp2/0)的準備：融合前兩周復蘇Sp2/0,置于5% C02、37°C恒溫培 養箱中傳代培養。培養過程在培養液中加入8-氮鳥嘌呤，連續處理3次，使Sp2/0細胞對 HAT培養液更加敏感。融合前一天傳代一次，使融合當天的骨髓瘤細胞處于對數生長期。
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