一種l-鳥氨酸的分離純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種L-鳥氨酸的分離純化方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 鳥氨酸是1877年，杰弗在喂養安息香酸的鳥類尿液的水解產物中發現的，因此得 名。它是細菌細胞膜和多肽類抗生素的組成成分，可以作為氨基酸輸液原料。能促進生長 激素的分泌，以協助機體代謝過多的脂肪，與精氨酸配合使用具有很好的減肥效果。在動物 體內主要參與尿酸循環，對于體內氨態氮的排出有重要作用。鳥氨酸是維持免疫系統和肝 功正常不可缺少的，能解毒氨及幫助肝再生，除在醫藥上作為試劑與注射液外，還通常與精 氨酸一起用作保肝、強身、解毒劑之類藥劑的原料。在皮膚和結締組織中含有高濃度的鳥氨 酸對于愈合和修復損傷組織非常有益。鳥氨酸是由體內的精氨酸合成的，反過來，它又是瓜 氨酸、脯氨酸和谷氨酸的前體。鳥氨酸能將氨轉化為尿素與谷氨酰氨，因此補充鳥氨酸可為 解毒途徑提供酶的作用物。當身體制造尿素，精氨酸便會被新陳代謝掉，身體轉為制造鳥氨 酸。用動物做的實驗證明鳥氨酸和精氨酸能令身體生產更多合成代謝的、促進生長的荷爾 蒙，包括胰島素和生長荷爾蒙，來促進肌肉生長。此外，鳥氨酸還用于配制恢復疲勞的發泡 飲料。
[0003] 在生物體內，鳥氨酸能在尿素循環（Krebs. Henseleit循環）中起作用。尿素循 環分為4步，能夠將生物體內天冬氨酸以及氨中的氮元素轉化為尿素，因而是生物體內的 主要排氨方式。動物利用新陳代謝將體內多余的氮元素轉化為尿素的主要器官是肝臟，體 內的精氨酸在精氨酸酶的催化作用下水解，產生尿素和鳥氨酸。精氨酸水解后產生的鳥氨 酸，將會與氨甲酰磷酸反應，進而產生瓜氨酸，瓜氨酸會進一步與天冬氨酸反應而生成精氨 基琥珀酸，精氨基琥珀酸最終會在酶的催化作用下進一步被分解為延胡索酸以及精氨酸等 產物。由于該反應的第一步是將精氨酸轉化為尿素，反應到最后又生成了精氨酸，周而復 始，所以該反應稱為尿素循環。由于目前全世界氨基酸產業的迅速發展，各地的科學家逐漸 認識到了 L-鳥氨酸的多種生物功能，其中日本最為突出，他們在20世紀40年代就開始對 L-鳥氨酸有所研究，在10-20年后就有許多文章發表，且多數是以專利的形式發表的。其 中包括鳥氨酸生產菌株、鳥氨酸高產菌株的選育、鳥氨酸的定量分析以及發酵法生產-鳥 氨酸的發酵條件優化等，并且以專利文獻的形式發表。但是此期間在國內卻很少聽到對 于-鳥氨酸的研究。直至1998年至2000年間，才報道有張克旭、潘韻和陳寧等人曾做過 關于L-鳥氨酸的菌種篩選和發酵方面的研究，有幾篇論文發表。與國外的研究相比，我國 L-鳥氨酸產業還處于起步階段，所研究的面很窄，而且研究進展較慢，目前僅發展到搖瓶試 驗階段，要進行工業化生產還需要我們進行大量的試驗和研究。和國外相比，我國對鳥氨酸 的研究有很大的差距，研究面窄，進展不大，僅限于搖瓶試驗，離工業化生產還有很長的路 要走。
[0004] 鳥氨酸是精氨酸的衍生物，在醫藥、保健、食品和化工等領域具有廣泛用途，市場 需求逐年增長，國內外尚無大規模生產的報道。鳥氨酸生產方法主要有化學法、微生物發酵 法和酶轉化法。化學法工藝繁雜，環境污染嚴重，副產物多且不易分離；微生物發酵法由于 缺乏性能優良的生產菌株和生產工藝的系統研究，限制了該方法的發展和應用。酶轉化法 是精氨酸在精氨酸酶的專一作用下生成鳥氨酸，產品純度高，是最具開發潛力的鳥氨酸生 產方法，優質廉價的精氨酸原料和轉化酶的獲得是該方法的關鍵。
[0005]鳥氨酸的生產方法有4種：發酵法：酶法；化學合成法和蛋白質水解提取法。
[0006] (1)發酵法發酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對菌株的 質誘變等處理，選育出各種營養缺陷型及氨基酸結構類似物抗性變異株，以解除代謝調節 中的反饋抑制與阻遏，達到過量合成某種氨基酸的目的。發酵法包括直接發酵法和添加前 體發酵法。氨基酸產生菌是實現發酵法生產氨基酸的前提，在氨基酸發酵的建立和改進中 起著非常重要的作用。根據氨基酸產生菌的遺傳性狀，可將其分為四類：第一類為直接使 用野生型菌株由糖和銨鹽發酵生產氨基酸，如谷氨酸；第二類為營養缺陷型變異株；第三 類為氨基酸結構類似物抗性變異株；第四類為營養缺陷型（或滲漏型）兼結構類似物抗件 變異株。應用發酵法生產鳥氨酸因產酸水平較低實用價值不大。發酵法主要是利用精氨酸 (Arg-)或瓜氨酸（Cit-)的營養缺陷型突變株來積累鳥氨酸。Takay asu等在營養缺陷型 菌株的基礎上篩選到具有霉酚酸抗性的突變株，最高產量可達50g/L;李環等利用混合菌 種發酵生產鳥氨酸，產量達40g/L左右。發酵法原料成本低廉，但是發酵液中成分復雜，后 續分離困難。
[0007] (2)化學合成法化學法制備鳥氨酸根據化學反應機理可分為有機合成法和精氨 酸水解法兩種。該法采用基礎化工原料合成鳥氨酸，原料來源廣泛且成本低。然而該法經 過多步化學反應合成，收率偏低；其原料中的氰化氫為劇毒致癌物，在工業生產中應盡量避 免使用。化學法合成出的鳥氨酸為DL型混合物，產物的手性拆分亦給該工藝增加了難度和 成本，這些方面都成為該法的主要缺陷所在。化學法是利用弱堿水解精氨酸得到鳥氨酸和 少量瓜氨酸。化學法生產鳥氨酸產物為DL-型外消旋體，分離困難，生產過程不易控制，現 已被淘汰。
[0008] (3)蛋白質水解提取法以毛發、血粉及廢蠶絲等蛋白質為原料，通過酸、堿或酶水 解成多種氨基酸混合物，經分離純化獲得各種氨基酸的方法稱為水解法。隨著氨基酸生產 技術的進步。由蛋白質水解法提取氨基酸這一古老的生產方法受到很大的沖擊，傳統的水 解法生產谷氨酸已失去其存在的價值。
[0009] (4)酶法酶法生產鳥氨酸就是利用動植物或微生物體內的精氨酸酶作催化劑，水 解精氨酸，生成鳥氨酸和尿素；酶法生產氨基酸具有工藝簡單、周期短、耗能低、專一性強、 收率高等特點。L-精氨酸酶廣泛存在于動物的肝臟、植物、酵母和細菌中傳統的酶法制備鳥 氨酸方法，采用以牛肝為酶源，從牛肝中提取L-精氨酸酶，以成品精氨酸為合成底物轉化 鳥氨酸。酶法生產鳥氨酸專一性強，反應條件溫和，避免采用氰化氫等有毒化學品，同時底 物轉化率高，產品較純，有利于后續分離，但是精氨酸酶的來源不易，底物精氨酸的成本也 較高。如何獲得廉價的合成底物和酶源是這一方法能否成功應用的關鍵。
[0010] 本技術采用發酵法生產的精氨酸純化液為原料，采用假單胞菌產生的精氨酸酶轉 化生產鳥氨酸，原料易得，酶成本低廉，結合固定化酶技術，可節約鳥氨酸生產成本，制造出 高質量的產品。申請人多年來致力于發酵法生產精氨酸及其衍生物關鍵技術的研究，擁有 年產500噸的精氨酸生產線。鑒于國內外市場需求強勁的現狀，申請人對鳥氨酸高效生物 制造技術及產業化進行研究，創造性的提出了微生物酶法生產鳥氨。依托現有精氨酸技術 和原料優勢，選育了生產鳥氨酸的精氨酸酶的高效菌株，以精氨酸為原料通過酶轉化獲得 鳥氨酸。本發明產品純度高易分離，同時克服了原料和酶昂貴不易獲取的劣勢，具有規模化 生產的前景。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的在于提供一株產精氨酸酶的菌株MQ0-154,本發明經過對蘇云金芽 孢桿菌（土壤分離）進行紫外誘變和化學誘變，篩選到一株精氨酸酶活性較高的菌株，經分 離純化后獲得菌株MQ0-154,其保藏編號為：CGMCC No. 10728 ;保藏單位為：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期為：2015年4月21日；保藏地址為：北京市朝 陽區北辰西路1號院3號。
[0012] 菌株MQ0-154的生物特性為：該菌株在斜面培養基上培養24h，成乳白色菌落，濕 潤，表面無光澤，菌苔厚且不透明，菌落較大，邊緣不規則菌體呈桿狀，細胞長約3-4 y m，直 徑1-2 ym，具有內生芽孢，不能運動，好氧或兼性厭氧。菌株MQ0-154的分類命名為蘇云金 芽抱桿菌（Bacillus thuringensis) 〇
[0013] 利用菌株MQ0-154制備精氨酸酶的方法，步驟如下：
[0014] (1)斜面培養：將菌株MQ0-154在無菌條件下接種到斜面培養基上進行培養，培養 溫度為33°C，培養時間為24h ;
[0015] 斜面培養基：葡萄糖 25g，魚蛋白胨 15g，KH2PO4O. 6g，MgSO4 ? 7H20 0? 5g， K2HPO4L 5g，瓊脂16g，加純凈水至1L，用NaOH調pH至為7. 0,滅菌溫度115°C，15min。
[0016] (2)種子擴大培養：從步驟（1)的斜面培養基上挑取菌落，加水稀釋獲得菌體溶 液，稀釋后的濃度為3 X 105-5 X IO5個/mL，將菌體溶液接種到種子培養基上進行擴大培養， 接種量為10% (v/v)，擴大培養的溫度為30°C，培養時間為24h，0-10h，搖床轉速100r/min， 10-20h，搖床轉速 120r/min，20-24h，搖床轉速 100r/min。
[0017] 種子培養基：葡萄糖 25g，乙酸銨 9g，KH2PO4O. 59g，K2HPO4L 5g，MgSO4 ? 7H200. 5g， FeSO40.0 5g，MnSO40.0 5g，VB1HCl 0? 005g，瓊脂 16g，加純凈水至 1L，用