一種具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥及其納米制劑和制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及腫瘤靶向遞送與緩釋給藥系統技術領域，尤其涉及一種具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥，該前藥的制備方法，及該前藥的納米制劑和該納米制劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]癌癥發病率呈逐年上升趨勢，目前已成為威脅人類健康最嚴重的疾病之一(Siegel R.L.et al, 2015, CA Cancer J Clin, 2015, 65:5-29) 0 化學藥物治療作為手術及放療之外一種重要的治療手段在全世界范圍內得到廣泛應用。但是，大多數化療藥物(如阿霉素、紫杉醇、喜樹堿等)存在水溶性差、不可控釋放、生物利用度低和毒副作用大等嚴重缺點。而一種新型抗癌藥物的研制常具有風險大、投資大和開周期長等不利因素。因此，如何針對現有抗癌藥物的不足，設計、開發新劑型以改進現有劑型的不足逐漸成為生物醫學領域研究的重要前沿和熱點之一。基于聚合物膠束的納米藥物制備方法多樣、化學修飾簡單，在抗癌藥的新劑型開發、應用方面展現出日益強大的技術優勢。
[0003]現有納米藥物通常采用物理包埋、吸附或共價改性的方式將抗腫瘤藥物制備成納米藥物，并在其表面進一步化學修飾腫瘤靶向分子以促進其在腫瘤組織附近富集進而達到提高療效的目的。一系列基于膠束納米粒子、脂質體、無機納米粒子(金納米粒子、量子點、石墨烯、碳納米管等)以及有機/無機雜化納米粒子的納米藥物被開發出來(如 Langer et al., Nat Nanotechnol.，2007，2(12):751-60 ;Chen et al., Adv.Mater.2014，65(1): 104-120)。值得指出的是絕大多數納米藥物以細胞內吞的方式進入細胞并在內涵體/溶酶體內釋放藥物。遺憾的是，藥物需要從內涵體/溶酶體中逃逸出來才能發揮抗腫瘤作用；而現有納米藥物體系通常并不具備良好的內涵體逃逸能力，這常常導致進入細胞的藥物在溶酶體中被降解掉，不能充分發揮其藥效。
[0004]為了更有效地將藥物運輸到細胞質中發揮作用，研究人員采用病毒、蛋白質、多肽、小分子化合物、光敏劑以及合成高分子等多種方式來打破內涵體/溶酶體的膜屏障。其中，合成高分子由于其精確的可設計性、可規模化制備以及良好的內涵體逃逸能力受到廣泛關注。近期，Stayton等將嵌段共聚物聚(N，N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)_b_ (N，N-二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯-Co-甲基丙烯酸正丁酯)，即PDMAEMA-b-P(DEA-co-BMA)用于基因傳輸(B1materials, 2012, 33, 2301-2309) 0 實驗結果表明，P (DEA-co-BMA)嵌段在BMA含量為30-40%時表現出強的內涵體逃逸能力。可能的原因是P(DEA-co-BMA)嵌段在內涵體/溶酶體的酸性環境(pH?5)中DEA由去質子化轉變為質子化，導致這種pH敏感膠束的解離，進而促使BMA基元的丁基與膜的磷酯雙分子層相互作用破壞了內涵體的膜。最終使得納米粒子從內涵體/溶酶體中逃逸出來。Liu等進而合成了具有內涵體逃逸功能的嵌段共聚物，聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)-b-(N，N-二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯-C0-甲基丙烯酸正丁酯)，即PDMA-b-P (DEA-co-BMA)，并在其兩個嵌段上分別標記上pH敏感的熒光染料和PH不敏感的內標分子。所得新型聚合物基pH熒光探針具有良好的內涵體逃逸功能并可靈敏地實時監測細胞質中pH變化過程(Liu et al., B1macromolecules, 2014, 15(11):4293-301)。
[0005]纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽，簡稱cRGD，是一種有效的革巴向肽，眾多實驗已經證實其對腫瘤血管具有很好的革G向效果(James et al., Adv DrugDeliver Rev, 2008, 60:1615-1626)。倘能將cRGD與響應性藥物納米粒相結合，構建對腫瘤組織具有良好特異性靶向功能的納米藥物，發明人相信其將會對改善藥物療效有一定的促進作用。
【發明內容】
[0006]針對現有技術中存在的種種不足，申請人旨在提供一種具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向藥物。
[0007]在本發明中，發明人通過可控聚合手段得到含有P(DEA-co-BMA)和聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(POEGMA)聚合物鏈、具有內涵體逃逸功能的刷形共聚物，并采用酯酶響應性
硫代酯鍵將抗腫瘤藥物蟾毒靈(BUF)共價連接到該聚合物上，采用穩定的酰胺鍵將對腫瘤新生血管具有特異性靶向功能的cRGD連接到該聚合物上，最后制備成具有內涵體逃逸功能的腫瘤革G向前藥及其納米制劑。其中，由于POEGMA的長鏈能使納米載體有效的逃逸網狀內皮系統的吞噬，從而達到長循環的目的。由于硫代鍵在酯酶作用下可以迅速水解釋放BUF原藥，使其發揮藥效，可以有效避免普通化學鍵改性藥物造成的藥物活性大幅度下降的問題。在高分子鏈上共價連接靶向肽cRGD促進其在腫瘤組織部位富集以提高藥物的生物利用度。同時，P (DEA-co-BMA)的引入，可以使得進入細胞內內涵體/溶酶體的納米藥物及時從中逃逸出來進入細胞質發揮藥效，可有效避免內涵體/溶酶體內強酸和強降解能力的酶對藥物分子的降解，提高藥物利用率。
[0008]因此，第一方面，本發明提供了一種具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥，其為P(OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)。其中，POEGMA為具有長循環功效的水溶性高分子，BUF為具有抗腫瘤活性的化療藥物蟾毒靈，cRGD為能夠有效主動靶向腫瘤組織的多肽，P (DEA-co-BMA)為具有內涵體逃逸功能的高分子。
[0009]為了制備上述P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)，本發明所要解決的另一個技術問題在于如何有效的將內涵體逃逸功能的P(DEA-co-BMA)、靶向肽cRGD和抗腫瘤藥物BUF整合到同一聚合物上，使之既能克服BUF水溶性差，生物利用度低問題又能夠有效避免傳統物理包埋的方法CPT在體內運輸過程中的早釋問題。同時，又能有效促使進入細胞內的納米藥物從內涵體/溶酶體中逃逸出來避免被降解，并真正發揮作用，從而最大限度地發揮藥物療效。
[0010]第二方面，本發明提供了一種上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法，包括以下步驟:
[0011](I)制備中間產物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA):
[0012]將一定量可逆加成斷裂鏈轉移引發劑BPTPA，寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯OE GMA，含β -硫代羧基的單體BSMA，含有原子轉移自由基引發劑的單體ΒΕΜΑ，溶劑和自由基引發劑加入玻璃管中，真空凍融三次后封管；之后，在20-80°C條件下反應0.5-40小時，得粗產物P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)，最后將該粗產物 P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)純化處理得所述 P(OEGMA-co-BSMA-co-B EMA)。
[0013](2)制備中間產物 P (OEGMA-co-BSMA)-g-P (DEA-co-BMA):
[0014]將一定量P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)、DEA、BMA、溶劑和銅鹽配體加入玻璃管中，真空凍融三次后加入銅鹽，再真空凍融兩次，然后封管；之后，在20-80°C條件下反應0.5-20小時，得粗產物P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA);最后將該粗產物P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA)過硅膠柱除去銅鹽，濃縮，再經純化處理得所述P (0EGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA)。
[0015](3)制備目標產物 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA):
[0016]將一定量P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA)、NHS-0H、BUF、縮合劑和催化劑溶于有機溶劑中室溫攪拌3-72小時；然后，加入一定量cRGD繼續反應1-48小時，得粗產物P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA);最后將該粗產物 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P(DEA-co-BMA)純化處理得所述 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)。
[0017]優選地，上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法中，所述純化處理為:水中透析，然后冷凍干燥。
[0018]優選地，上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法中，所述步驟(I)中的所述OEGMA的分子量為100-50000。
[0019]優選地，上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法中，所述步驟(I)中的所述溶劑選自DMF、DMS0、NMP、異丙醇、甲醇、乙醇、二氧六環和四氫呋喃中的一種或多種。
[0020]優選地，上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法中，所述步驟(I)中的所述自由基引發劑選自過氧化環己酮、過氧化二苯甲酰、叔丁基過氧化氫、偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈中的一種或多種。
[0021]優選地，上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法中，所述步驟(I)中的所述引發劑BPTPA:OEGMA:BSMA:BEMA:自由基引發劑的摩爾比為1:10-200:0.5-200:
0.5-200:0.0l-10
[0022]優選地，上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法中，所述步驟(2)中的所述溶劑選自DMF、DMSO, NMP、異丙醇、甲醇、乙醇和四氫呋喃中的一種或多種。
[0023]優選地，上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法中，所述步驟(2)中的所述銅鹽配體選自聯吡啶、PMDETA和Me6TREN中的一種或多種。
[0024]優選地，上述具有內涵體逃逸功能的腫瘤靶向前藥的制備方法中，所述步驟(2)中的所述銅鹽選自溴化亞銅、氯化亞銅、溴化銅和氯化銅中的一種或多種。