一種胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液及凍存方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及干細胞領域，具體涉及一種胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液及凍 存方法。
【背景技術】
[0002] 干細胞（stemcell)是一類具有自我復制能力（self-renewing)的多潛能細胞。 在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。間充質干細胞（Mesenchymalstemcells， MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC具有自我復制、 自我更新、多方向分化潛能、造血支持以及免疫調控等特性。在特定的機體外分化環境下， 能夠誘導分化為神經、心臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細胞，被認為是細胞治療技術 的最有希望的來源細胞之一。除此以外，間充質干細胞能分泌多種營養物質，包括血管內 皮生長因子（vEGF)、胎盤生長因子（PGF)、成纖維細胞生長因子（FGFs)、血小板源生長因子 (TOGF)、轉化生長因子（TGF-P)、肝細胞生長因子（HGF)等在內的各種生長因子，這些生長 因子可參與多種細胞反應，促進細胞生長，而收集條件培養基是獲得這些活性成分的有效 方法。
[0003] 人羊膜來源于人胎盤組織，無血管、神經及淋巴，羊膜屬于孕婦生產后的廢棄物， 一個胎盤的羊膜面積大約有600cm2,而且羊膜易于從胎盤剝離，所以因羊膜具有取材方便， 原料充足的特點而被認為是目前間充質干細胞的最佳來源，是未來干細胞在醫療應用上具 有巨大潛力的理想種子細胞。
[0004] 間充質干細胞在體外經過連續傳代培養和凍存復蘇后仍具有多向分化潛能，可作 為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。因此，研究一種有效的胎盤 羊膜間充質干細胞的凍存方法，使具有臨床應用價值的胎盤羊膜間充質干細胞能在體外長 期保存并維持原有的多向分化能力，顯得尤為重要。
[0005] 胎盤羊膜間充質干細胞的凍存需要將處于對數生長期的細胞收集起來，加入含有 特定成分的細胞凍存保護液制成單細胞懸液，分裝于凍存管中置于超低溫冰箱或者液氮中 進行長期凍存。
[0006] 目前現有技術中，胎盤羊膜間充質干細胞的細胞凍存保護液配方一種是以DMS0 和血清為主要成分，另一種是以培養基、DMS0和血清為主要成分。此外還有一些配方是在 上述兩種配方的基礎上添加其他保護細胞的物質。但上述配方凍存胎盤羊膜間充質干細胞 均效果不理想，復蘇后細胞回收率及細胞活率低。
【發明內容】
[0007] 有鑒于此，本發明目的在于針對現有技術存在的問題，提供一種胎盤羊膜間充質 干細胞的凍存保護液及凍存方法。
[0008] 為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[0009] -種胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液，包括
[0010] DMSO 10v/v% -20v/v%
[0011] 胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基 30v/v%-80v/v%
[0012] 胎牛血清 10v/v% _50v/v%。
[0013] 其中，所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液中所述胎盤羊膜間充質干細胞條 件培養基的制備方法為：取P1-P5代的胎盤羊膜間充質干細胞酶解消化后傳代，連續培養 24_72h后，收集培養上清，離心后取上清。
[0014] 在一些實施方案中，所述胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基的制備方法中所述 P1-P5代的胎盤羊膜間充質干細胞優選為匯合度80-90%胎盤羊膜間充質干細胞。
[0015] 在一些實施方案中，所述胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基的制備方法中所 述酶解消化具體為向細胞中加入〇. 〇 15mL/cm2-0. 04mL/cm2的0. 05 % -0. 3 %的胰酶和 0. 01 % -0. 04%EDTA消化lmin-3min，完全培養基終止酶解。
[0016] 在一些優選實施方案中，所述終止酶解的完全培養基的加入量為消化液體積的5 倍~10倍。
[0017] 在一些實施方案中，所述胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基的制備方法中所述傳 代為酶解消化后的細胞離心，完全培養基重選后，按80000個細胞/cm2-15000個細胞/cm2 的傳代密度傳代，細胞連續生長24h-72h。
[0018] 其中，所述酶解消化后的離心優選為200g-400g離心5min。
[0019] 本領域技術人員可以理解，本發明所述完全培養基的組成為DMEM-F12 80v/ v%_95v/v%，FBS5v/v%_20v/v%。
[0020] 本發明所述胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基的制備方法在胎盤羊膜間充質干 細胞傳代后收集培養上清，離心后取上清獲得胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基。其中，所 述離心優選為200g_400g離心5min。
[0021] 本發明還提供了所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液的制備方法，按比例將 胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基與胎牛血清混合，然后加入DMS0,冰水浴中降溫至0°C。
[0022] 本發明還提供了一種胎盤羊膜間充質干細胞的凍存方法，將胎盤羊膜間充質干 細胞消化離心，加入胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基，調整細胞密度至〇. 1X106個/ mL-10X106個/mL，加入等體積的所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液，混勻后，分裝 至凍存管中，-80°C中凍存1天-5天，轉移至液氮中長久保存。
[0023] 其中，所述的凍存方法中，所述消化為向細胞中加入0. 015mL/cm2-0. 04mL/cm2的 0. 05% -0. 3%的胰酶和0. 01 % -0. 04%EDTA消化lmin-3min，用5倍-10倍于消化液的完 全培養基終止酶解。
[0024] 在一個具體實施例中，本發明分別采用不同的凍存保護液凍存胎盤羊膜間充質干 細胞，比較不同的凍存保護液凍存復蘇后細胞回收率、細胞活率以及細胞增殖情況，對比本 發明所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液與常規凍存液的凍存效果，結果顯示雖然細 胞活率沒有明顯差異，但經本發明所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液凍存后復蘇的 細胞回收率明顯高于其他常規凍存液。而增殖情況結果顯示本發明所述胎盤羊膜間充質干 細胞的凍存保護液凍存的細胞相對常規凍存液凍存的細胞，擴增的倍數更多。
[0025]由此可見，采用本發明所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液，結合本發明所 述的凍存方法進行胎盤羊膜間充質干細胞的凍存，將起到更好的凍存效果。復蘇后的細胞 不僅在回收率上明顯高于其他常規凍存液，細胞增殖能力也優于常規凍存液。
[0026] 本發明還提供了一種胎盤羊膜間充質干細胞的凍存試劑盒，包含本發明所述胎盤 羊膜間充質干細胞的凍存保護液。
[0027] 本發明所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液包括10v/v% -20v/v%DMS0、 30v/v% -80v/v%胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基、10v/v% -50v/v%胎牛血清。與常規 細胞凍存液相比，采用本發明所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存保護液凍存后復蘇，不僅 在細胞回收率上明顯高于其他常規凍存液，細胞增殖能力也優于常規細胞凍存液，可以用 于間充質干細胞的長期保存及應用。本發明所述胎盤羊膜間充質干細胞的凍存方法將胎盤 羊膜間充質干細胞消化離心后，加入胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基，調整細胞密度，加 入等體積的本發明所述凍存保護液后凍存細胞。與常規的凍存方法相比，本發明胎盤羊膜 間充質干細胞的凍存方法凍存的細胞復蘇后不僅在細胞回收率上明顯高于其他常規方法， 細胞增殖能力也優于常規的凍存方法。
【附圖說明】
[0028] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0029] 圖1示實施例1復蘇后各組細胞增殖情況圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0031] 為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例對本發明進行詳細闡述。
[0032] 對比例1、
[0033] 分別采用表1中不同的凍存保護液凍存胎盤羊膜間充質干細胞，比較不同的凍存 保護液凍存復蘇后細胞回收率、細胞活率以及細胞增殖情況。
[0034] 表1不同的凍存保護液
[0035]
[0036] 凍存方法如下：
[0037] 1、配制胎盤羊膜間充質干細胞條件培養基：取匯合度80%的P2代的胎盤羊膜間 充質干細胞，用PBS洗2遍后，往細胞中加入0. 015mL/cm2的0. 25 %的胰酶+0. 04%EDTA消 化lmin，用10倍于消化液的完全培養基終止酶解，200g離心5min，用完全培養基重選后， 接種于培養瓶中，傳代密度為10000個細胞每cm2。細胞連續生長48h，收集培養上清，200g 離心5min，取上清，分裝后置于-80°C保存備用。
[0038] 2、取匯合度80%的P3代的胎盤羊膜間充質干細胞，用PBS洗2遍后，往細胞中加 入0. 015mL/cm2的0. 25 %的胰酶+0. 04%EDTA消化lmin，用10倍于消化液的完全培養基 終止酶解，取樣計數