一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素i的雙抗夾心法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素 I (SEI)的方法，具體涉及的是 一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素 I的雙抗夾心法。
【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌腸毒素 （staphylococcal enterotoxins，簡稱SEs)，是一種由金 黃色葡萄球菌分泌的細胞外毒素，其會導致中毒休克、食物中毒及一系列過敏性、免疫學疾 病。目前已發現的腸毒素有23種血清型，其中SEA-SEE稱為傳統腸毒素，SEG-SEX為新型 腸毒素。其中SEI也屬于新型腸毒素，它是由729個核苷酸構成，表達一個具有242個氨基 酸殘基的成熟蛋白質，理論分子量為24. 928 KD。
[0003] 人類對于各型SEs最低耐受劑量不一，目前能引起中毒的腸毒素基因主要包括 SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SH^、SEG和SEI，其中A型腸毒素毒力最強，攝入lμg即能引起 食物中毒。但研宄表明，金黃色葡萄球菌腸毒素基因的各分型分布中，基因分布較廣。 在臨床研宄中發現，攜帶基因的金黃色葡萄球菌致病菌株的檢出率高達89. 5%。基于 基因流行的廣泛性，新型腸毒素 SEI潛在威脅人類健康。因此，食品及其原料中SEI的 檢出，對控制SEI引起的食源性疾病具有重大意義。
[0004] 目前檢測腸毒素的方法主要有免疫學法、分子生物學法和生物傳感器法。
[0005] 基因往往以基因簇（e#)的形式存在，且腸毒素基因簇往往受同一操縱子調 控，從而導致一株葡萄球菌能同時表達兩種以上的腸毒素。因此，國內外研宄重點是利用多 重PCR法對葡萄球菌腸毒素進行快速分型。PCR技術可從基因水平進行診斷，并能同時檢 測大量樣品，其高靈敏度和特異性可以直接應用于檢測各類金黃色葡萄球菌產腸毒素的基 因。但PCR法只能判斷葡萄球菌攜帶腸毒素的基因型，天然葡萄球菌腸毒素的表達往往受 到時間、水分活度（AW 0. 85~0. 99)、酸堿度（pH 4. 0~7. 0)和溫度（8°C ~30°C)等因素的影 響，用PCR法很難對準確測定食品或臨床樣本中腸毒素蛋白的含量。
[0006] 免疫學檢測法依靠抗原抗體的結合，其只發生在抗原決定簇與抗體結合位點之 間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，因此，免疫學檢測法具有高度的特異 性。生物傳感器技術因其具有自動化、檢樣量少、分析速度快、生物功能膜可多次使用等優 點受到國內學者的親睞。最新研發的電化學免疫傳感器對腸毒素最低檢出限可達〇.〇17ng/ mL。但由于該方法檢測成本高，檢測穩定性較差，理論不成熟，使該方法的發展受到限制。另 一種酶聯免疫吸附（ELISA)法因其具有操作簡單、低成本、靈敏度高，特異性強、重復性強、 穩定性高等優點，成為國內外研宄熱點。
[0007] 目前，利用雙抗體夾心法檢測傳統腸毒素的技術較為成熟，其靈敏度高達 0.0282ng/mL。但目前利用雙抗體夾心法檢測新型腸毒素的報道較少，特別是關于SEI的檢 測采用該方法還未見報道，因此，雙抗體夾心法在金黃色葡萄球菌新型腸毒素檢測上將具 有相當廣泛的應用價值。
【發明內容】
[0008] 本發明的主要目的在于提供一種即可定性分析、也可定量檢測，且靈敏度高、準確 度高的檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素 I的雙抗夾心法。
[0009] 為達到上述目的，本發明的技術方案如下： 一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素 I的雙抗夾心法，包括以下步驟： (1) 用包被抗體包被酶標板，洗板，用于洗去未與酶標板結合的包被抗體，該包被抗體 為SEI單克隆抗體； (2) 加入封閉液對酶標板上多余結合位點進行封閉，洗板，用于洗去酶標板上多余封閉 液； (3) 在酶標板上加入樣品，孵育后洗板； (4) 以SEI兔抗血清為一抗加入酶標板，反應后洗板，再以辣根過氧化物酶標記的羊抗 兔IgG為酶標二抗，反應后洗板； (5) 加入顯色液使酶標板顯色，然后加入硫酸終止反應，用酶標儀檢測OD45tl, (6) 將檢測得到的OD45tl值帶入標準曲線即可求得樣品中SEI的含量； 當樣品中SEI濃度多0. 5 ng/mL，樣品中SEI被配對抗體捕獲與酶標二抗結合，并催 化底物在450 nm產生吸收值時，被判定為陽性； 當樣品中SEI濃度< 0. 5 ng/mL，樣品中SEI不被配對抗體捕獲或者捕獲數量太小不足 以引起足夠的信號時，被判定為陰性。
[0010] 本發明記載的方法對不同濃度的標準SEI進行0045(|值檢測后，得到的線性范圍良 好，可以直接做成標準曲線，通過對樣品的(》45(|值檢測后，用該值在標準曲線上找出對應的 濃度，即可實現樣品的定量檢測。
[0011] 兔抗血清中存在非特異性蛋白，因而其很難達到較高的特異性，若選作包被抗體， 易造成假陽性，不利于抗原蛋白檢測，導致檢測的準確率較低。本發明將僅針對一種抗原決 定簇的SEI單克隆抗體作為包被抗體，將SEI兔抗血清作為一抗加入反應體系中，不僅克服 了直接使用兔抗血清所帶來特異性問題，還提高了方法的靈敏度和準確性。
[0012] 目前常采用的Dot-ELISA檢測法以硝酸纖維（NC)膜為固相載體，據文獻報道，硝 酸纖維膜對蛋白的固定易受到非特異性蛋白、氫鍵作用干擾物、疏水作用干擾物的影響，從 而使膜上蛋白物理吸附能力變弱，易造成假陰性。而本發明采用聚苯乙烯酶標板作為固相 載體，其物理吸附能力較強，性質穩定，因而能克服因蛋白吸附問題而造成的假陰性。
[0013] 進一步，本發明優化了抗體包被濃度、一抗稀釋度、酶標二抗稀釋度、包被液、封閉 時間、標準品孵育時間、酶標抗體孵育時間、TMB顯色時間等。通過該條件的設置可使檢測 靈敏度達到0. 133 ng/mL，最低檢測限0. 5 ng/mL，R2達到0. 9933。
[0014] 本發明中各步驟的具體工作條件和過程如下： 所述步驟（1)的具體過程如下：用2. 2~3. 5 μ g/mL的SEI單克隆抗體包被酶標板并在 4°C過夜，該SEI單克隆抗體的加入量優選為100 μ L/孔。
[0015] 所述步驟（2)的具體過程如下：以5120%脫脂奶粉為封閉液，在37°C下封閉I h~2 h，該封閉液的加入量優選為200 μ L/孔。
[0016] 所述步驟（3)中孵育的溫度為37°C，孵育的時間為60~90 min。
[0017] 所述步驟（4)中一抗加入后在37°C下反應I h ;所述酶標二抗加入后在37°C下反 應30~45 min。該一抗和酶標二抗的加入量均優選為100 μ L/孔。
[0018] 所述步驟（5)中顯色液加入后在37°C避光顯色10~15 min ;所述硫酸濃度為2 mol/L。該顯色液和硫酸的加入量均優選為100 μ L/孔。
[0019] 其中，所述步驟（1)中的包被抗體、步驟（2 )中的封閉液、以及步驟（4 )中的一抗和 酶標二抗均采用ρΗ=7. 4的I X PBS進行稀釋，一抗的稀釋比例為1:2000 ~ 1:4000,酶標 二抗的稀釋比例為1:6000 ~ 1:8000。
[0020] 所述步驟（1)~步驟（4)中洗板的操作過程如下：倒去酶標板孔內液體，在吸水紙 上拍干，用含〇. 05% Tween-20的PBST加滿孔，靜置3 min，反復洗滌3~5次。
[0021] 所述顯色液由10 mL顯色液A、125 μ L顯色液B、15 μ L 3% H2O2配置而成；其中 顯色液A由3. 5 g的Na2HPO4.12H20、1. I g的檸檬酸混合后加水至200 ml，并調節pH值至 5.0后制得；顯色液B由6 mg的3. 3'，5, 5'-四甲基聯苯胺（TMB)加入I mL二甲基亞砜 (DMSO)混合制得。
[0022] 本發明與現有技術相比，具有以下優點及有益效果： 1、 本發明不僅能有效對新型腸毒素 I進行定性分析，還能有效對新型腸毒素 I進行定 量檢測，且檢測準確度高； 2、 本發明中的試劑穩定、易保存，且操作簡單、低成本、靈敏度高，特異性強、重復性強、 穩定性高；且本發明能同時檢測大量樣品，適用于SEI檢測和流行病學調查，具有良好的應 用前景。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明方法檢測得到的標準曲線。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例及其附圖，對本發明作進一步地詳細說明，但本發明的實施方式 不局限于此。 實施例
[0025] 一、準備階段 本階段用于配置好相應濃度的各試劑物品等，本發明中所用試劑物品包括：包被抗體、 封閉液、樣品、一抗、酶標二抗、顯色液、硫酸。
[0026] 其中，酶標板為96孔聚苯乙烯可拆酶標板；該包被抗體為SEI單克隆抗體，SEI單 克隆抗體濃度為2. 2 ~ 3. 5 μ g/mL，封閉液濃度為5% ~ 20%的脫脂奶粉溶液，該SEI單克 隆抗體和封閉液均采用pH=7.4的I X PBS配置而成。樣品包括檢測樣品和濃度分別為 0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL的 SEI 標準品稀釋液。一抗為SEI兔抗血清，酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，辣根 過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為市售產品，購自武漢三鷹生物技術有限公司。硫酸濃度為 2 mol/L〇
[0027] 所述SEI單克隆抗體的制備方法如下：以重組表達的SEI為免疫原，免疫6~8周齡 的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周進行初免，皮下多點注射；此后，每隔兩周免疫一次， 共免疫三次，尾部采血測效價，選擇效價最高的老鼠。再細胞融合前3天沖擊免疫一次。眼 眶采血后進行融合，篩選采用間接ELISA進行，共篩選到2個細胞株；其中1株性質穩定， SEI單克隆抗體產量高。
[0028] 所述SEI兔抗血清的制備方法如下：將0. 3 mg SEI與等量弗氏完全佐劑混合，皮 下多點注射雌性新西蘭大白兔1.0 mL ;3周后，以0.15 mg SEI與等量弗式不完全佐劑混 合，皮下多點注射新西蘭兔I. 〇 mL ;3周以后每隔2周分別以0. 15 mg/只耳靜脈注射新西 蘭兔，最后1次免疫后7~10天內，頸動脈采全血，37°