淫羊藿破壁飲片的指紋圖譜共有模式構(gòu)建及其質(zhì)量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥飲片的建立檢測(cè)方法，尤其是淫羊藿破壁飲片HPLC指紋圖譜共 有模式構(gòu)建及其質(zhì)量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimediumbrevicornu Maxim、箭葉淫羊藿 Epimediumsagittatum(Sie. et Zucc.)、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或卓月鮮 淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥葉。本發(fā)明中的淫羊藿針對(duì)小檗科植物淫羊藿 Epimediumbrevicornu Maxim品種。
[0003] 主要成分為黃酮、木脂素、生物堿和多糖。黃酮類(lèi)成分主要有：淫羊藿苷，朝藿定 A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I、II，淫羊藿次苷I、II，大花淫羊藿苷A，鼠李糖基淫羊藿次 苷II，箭藿苷A、B、C和金絲桃苷等。
[0004]中藥破壁飲片是利用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)飲片進(jìn)行破細(xì)胞壁粉碎成粒度分 布D90小于45ym的微細(xì)顆粒，再制成30~100目的顆粒。相對(duì)于傳統(tǒng)飲片具有色澤一致， 質(zhì)量均一，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)為創(chuàng)新型中藥飲片。由于中藥破壁飲片不具傳統(tǒng)中藥飲片的形 態(tài)特征，破壁后會(huì)帶來(lái)有效成分或指標(biāo)成分等化學(xué)成分的溶出度變化，使傳統(tǒng)飲片的鑒別、 質(zhì)量檢測(cè)方法不能完全適用。因此，必須針對(duì)中藥破壁飲片建立專(zhuān)屬性強(qiáng)，全面反映中藥破 壁飲片質(zhì)量狀況的檢測(cè)方法。而建立一項(xiàng)新的質(zhì)量檢測(cè)方法并非易事，例如檢測(cè)條件、對(duì) 照品的選擇和供試品的制備方法等均需要研宄考量并進(jìn)行驗(yàn)證。雖然現(xiàn)有技術(shù)中有涉及中 藥指紋圖譜的檢測(cè)方法，但并無(wú)針對(duì)形態(tài)特殊的中藥破壁飲片的方法，且存在專(zhuān)屬性、穩(wěn)定 性、重現(xiàn)性和精密度差缺陷，不能全面反應(yīng)飲片質(zhì)量的缺陷。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明提供了一種淫羊藿破壁飲片HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建及其質(zhì)量檢測(cè)方 法。
[0006] 淫羊藿破壁飲片HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0007] (1)供試品溶液的制備：精密稱(chēng)定淫羊藿破壁飲片0. 200g，加入50%稀乙醇20mL， 超聲提取3〇111；[11，冷卻至室溫，12001'/111；[11離心5111；[11，上清液傾入201111量瓶中，加50%稀乙 醇稀釋并定容至20ml，搖勻，0.22um微孔濾膜過(guò)濾備用；
[0008] (2)對(duì)照品配制：精密稱(chēng)取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解配制成濃度分別為 0? 116mg/ml的混合對(duì)照品溶液；
[0009] (3)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜 柱，以乙腈為流動(dòng)相A，水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0min-20min-28min-60min，流動(dòng)相 A:20% -27% -27% -50%;柱溫為35°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為272nm ;流速：0? 8mL/min ;
[0010] (4)測(cè)定法：精密吸取供試品溶液20yl，對(duì)照品10ul注入色譜儀，測(cè)定，記錄圖 譜，即得；
[0011] (5)按上述供試品溶液及對(duì)照品的制備方法及和色譜條件對(duì)10批以上的淫羊霍 破壁飲片樣品進(jìn)行HPLC分析，得到相應(yīng)指紋圖譜；以淫羊藿苷峰為參照峰，計(jì)算各指紋圖 譜中主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積；輸入指紋圖譜分析軟件，對(duì)各批次樣品指 紋圖譜進(jìn)行相似度比較，以平均譜圖為共有模式，計(jì)算相似度，建立淫羊藿破壁飲片指紋圖 譜共有模式標(biāo)準(zhǔn)圖譜如圖3所示，包括16個(gè)特征峰。
[0012] 淫羊藿破壁飲片的質(zhì)量檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0013] (1)按上述標(biāo)準(zhǔn)圖譜構(gòu)建方法中步驟（1)和步驟（2)分別制備待測(cè)樣品供試品溶 液和對(duì)照品溶液，按步驟（3)的色譜條件，精密吸取待測(cè)樣品供試品溶液20yl，淫羊藿苷 對(duì)照品10ul，注入HPLC色譜儀，測(cè)定，記錄色譜，即得；
[0014] (2)合格指標(biāo)的建立及指定圖譜、判斷方法：供試品色譜中，應(yīng)呈現(xiàn)16個(gè)與圖 3-淫羊藿破壁飲片HPLC指紋圖譜共有模式相對(duì)應(yīng)的特征峰。按中藥色譜指紋圖譜相似度 評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度不得低于〇. 90。以淫羊藿苷峰為 對(duì)照峰，其余15個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0. 248、0. 507、0. 691、0. 772、0. 829、 0? 875、0. 931、0. 966、1. 128、、1. 262、1. 458、1. 652、1. 667、1. 781、1. 832,各峰相對(duì)保留時(shí)間 RSD彡±5%，為合格品。
[0015] 本發(fā)明是首次針對(duì)淫羊藿破壁飲片質(zhì)量控制所構(gòu)建的HPLC指紋圖譜共有模式標(biāo) 準(zhǔn)圖譜及質(zhì)量檢測(cè)方法。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)不能完全適用淫羊藿破壁飲片質(zhì)量控制的 缺陷。該圖譜較全面涵蓋了淫羊藿飲片主要活性成分的圖譜信息，專(zhuān)屬性明顯優(yōu)于現(xiàn)有的 同類(lèi)指紋圖譜方法。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和精密度均達(dá)到法定要求，且操作 簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速準(zhǔn)確；并能有效控制淫羊藿藥材、破壁粉體、破壁飲片整體質(zhì)量。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是淫羊藿破壁飲片指紋圖譜柱子適用性考察譜圖。
[0017] 圖2是淫羊藿破壁飲片專(zhuān)屬性考察。
[0018] 圖3是本發(fā)明淫羊藿破壁飲片HPLC指紋圖譜共有模式標(biāo)準(zhǔn)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 一、淫羊藿破壁飲片HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建。
[0020] 本發(fā)明以淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷B、淫羊藿次苷I、淫羊藿 次苷II、綠原酸8個(gè)主要活性成分為目標(biāo)，建立能較全面反映淫羊藿破壁飲片成分信息，同 時(shí)能測(cè)定淫羊藿苷含量的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0021] 1儀器與試藥
[0022] 1. 1 儀器
[0023] 安捷倫1200RRLC快速液相色譜儀（配有G1315C型號(hào)DAD檢測(cè)器、G4218A的ELSD 蒸發(fā)光檢測(cè)器、G1312B二元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1322A脫氣機(jī)、G1316B柱溫箱，Agilent Chemstation色譜工作站）、萬(wàn)分之一電子分析天平、十萬(wàn)分之一電子分析天平、高功率數(shù) 控超聲清洗儀等
[0024] 1. 2 試藥
[0025]試劑：甲醇（瑞典進(jìn)口Oceanpak色譜溶劑），乙腈（安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑公司色譜 純），雙蒸水、磷酸、甲醇（分析純）。淫羊藿苷對(duì)照品（110737-201312)。
[0026] 供試品：淫羊藿破壁飲片、淫羊藿破壁粉體、淫羊藿原料藥材（均由中山中智藥業(yè) 集團(tuán)提供）
[0027] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0028] 2. 1預(yù)試驗(yàn)
[0029] 中智淫羊藿破壁飲片主要采用小檗科淫羊藿屬淫羊藿藥材經(jīng)過(guò)超微粉碎加工而 制成。本研宄在參考公司內(nèi)部非公開(kāi)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，專(zhuān)門(mén)針對(duì)淫羊藿破壁飲片，擬定以下幾 個(gè)方案進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。
[0030] 2. 1. 1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 1
[0031] 樣品制備：精確稱(chēng)取0. 2001g淫羊藿破壁飲片（14040101批次），于50ml具塞錐 形瓶中，加入20ml70%的乙醇溶液，浸潤(rùn)30min，稱(chēng)定重量，超聲30min，取出，冷卻至室溫， 用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，粗濾，〇. 22um微孔濾膜過(guò)濾備用。
[0032] 色譜條件 1:agilentzorbaxSBC18 (4. 6mmX250mm，5um)色譜柱，柱溫 30°C， 流速lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)268nm、270nm、272nm、280nm，流動(dòng)相：乙腈-水，預(yù)梯度1洗脫： 0min-30min-60min,乙腈變化為：5% -100% -5%，進(jìn)樣量為 10ul。
[0033] 色譜條件 2:agilentzorbaxSBC18 (4. 6mmX250mm，5um)色譜柱，柱溫 30°C， 流速lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)268nm、270nm、272nm、280nm，流動(dòng)相：乙腈-水，預(yù)梯度2洗脫： 0min_60min，乙腈變化為：5% -100%，進(jìn)樣量為10ul。