一種多巴胺功能化磁性納米載體的制備及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于蛋白質的固定化領域，涉及一種多巴胺功能化磁性納米載體的制備及其應用。
【背景技術】
[0002]酶主要是由蛋白質組成的具有催化活性的物質，由于其催化活性高和對底物轉一性強等特點，在食品、釀造、醫藥、環境和化學制品等領域具有廣泛的應用前景。但是，游離酶的穩定性差，極易在極端條件如高溫、強酸和強堿下變性失活，而且其在催化反應后難以與底物及產物分離，造成了產品污染和生產成本的增加，大大的限制了其在工業上的應用。為了解決以上游離酶的不足，20世紀60年代提出了固定化酶的概念，酶固定化是指使酶在一定空間內呈閉鎖狀態的過程，制備的固定化酶能連續進行催化反應。研究結果表明，固定化酶不僅保持了酶的專一性和高效性，同時也增強了酶的穩定性，容易與底物及產物分離，實現回收利和連續化生產，提高了產品的產率及質量。
[0003]磁性納米材料作為一種新型材料，具有毒性小、磁響應強、易分離回收和成本低等優點，在固定化酶領域有著不斷深入的研究及應用(參見Ugelstad, H.R.Mfutakamba, P.C.M0rk，et al., Preparat1n and applicat1n of monodispersepolymer particles.J.Polym.Sc1.Polym.Symp，1985) DKouassi等以EDC活化的磁性Fe3O4納米粒子為載體，成功的制備了固定化膽固醇氧化酶，并將其用于血清中膽固醇含量的分析(參見:G.K.Kouassi , J.1rudayaraj , G.McCarty.Examinat1n ofCholesterol oxidase attachment to magnetic nanoparticles，J.Nanob1technology，2005)DPan等利用戊二酸為活化劑，將β-D-galactosidase共價固定于表面包覆有殼聚糖的磁性Fe304納米載體上，實驗結果表明，所制得的固定化的β-D-galactosidase具有較高的酶活力和穩定性(參見:C.Pan, B.Huj ff.Li，et al.Noveland efficient method for immobilizat1n and stabilizat1n of β-d-galactos idase by covalent attachment onto magnetic Fe3〇4-chitosannanoparticles.J.Mol.Catal.B Enzym.2009) jural等首先米用SiC>2修飾磁性Fe3〇4納米粒子，然后再利用γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷對其進行修飾，使其表面帶有環氧基功能基團，以此功能性粒子為載體對苯甲酰甲酸脫羧酶進行固定化，可得到載酶量為6.75mg/g，酶活收率為53%的固定化酶(參見:B.Tural，T.Tarhan，S.Tural，Covalent immobilizat1n of benzoylformate decarboxylase from Pseudomonasputida on magnetic epoxy support and its carboligat1n reactivity, J.Mol.Catal.B Enzym.2014)。然而，這些固定化方法不僅操作繁瑣，而且需要加入偶聯劑，對酶的活性有一定的影響，需要改進。本發明利用多巴胺(dopamine)對磁性納米粒子進行包覆，得到功能化磁性載體表面具有大量醌基及氨基的，生物兼容性優異，能夠在極溫和條件下與酶蛋白發生共價反應，實現酶蛋白的共價固定化。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種高效的共價固定化酶等蛋白質的方法，無需加入偶聯劑，且操作簡便。
[0005]本發明的另一目的是提供這種用于有效共價固定化酶等蛋白質的功能化磁性納米載體的制備方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
一種多巴胺功能化磁性納米載體的制備方法，包括如下步驟:
(I)將FeS044H20和FeC136H20充分溶于蒸餾水中，然后轉移至三頸圓底燒瓶中，在合適溫度下，高速攪拌和氮氣保護條件下，迅速加入25% NH4OH的氨水反應后，加入油酸;攪拌反應后獲得的黑色沉淀用無水乙醇和超純水反復清洗至上清液無色透明，強磁鐵沉淀分離，于真空烘箱中50°C烘干，得到油酸磁性納米顆粒稱為Fe3O4OOA。
[0007](2)稱取一定量的多巴胺鹽酸鹽溶解于Tris-HCl溶液中，配制成多巴胺鹽酸鹽溶液;將上述制備的油酸磁性納米顆粒研磨均勻加入到多巴胺鹽酸鹽溶液中，超聲混勻后反應，反應結束置空氣中快速攪拌;攪拌結束后，用磁鐵分離，獲得的深棕色沉淀用乙醇和蒸餾水清洗，于真空烘箱中50°C烘干，得到磁性納米顆粒稱為多巴胺功能化磁性納米載體，記為 Fe304@0A@DP。
[0008]其中，步驟(I)中所述FeS044H20和FeC136H20的摩爾比為1:1?1:5;
所述的合適溫度為50-90 °C；
所述FeS044H20的物質的量與25% NH4OH的體積比例為0.5?2 mmol/mL；
所述加入氨水后反應時間為5-20min ；
所述加入的油酸體積為總溶液體積的0.1-1%；
所述攪拌反應時間為20-50min;
其中，步驟(2)中所述多巴胺鹽酸溶液的濃度為I?10 mg/mL;優選為2 mg/mL；
所述多巴胺鹽酸溶液中油酸磁性納米顆粒的濃度為10 mg/mL；
所述超聲時間為10?50 min;反應溫度為25-30 °C，反應時間為2_24 h；
所述快速攪拌時間為12 ho
[0009]上述方法所得到的多巴胺功能化磁性納米載體用于酶等蛋白質的固定化的應用，具體應用方法為:
稱取干燥的多巴胺功能化磁性納米載體(磁性Fe304@0A@DP納米載體)多份，分別加入經緩沖液稀釋的蛋白質或酶溶液，振蕩混勻后固定化反應，通過Fe3O4OOAODP表面的醌基與蛋白質或酶分子中的氨基發生化學反應將蛋白質或酶固定在載體表面;反應結束后，離心收集固定化蛋白質或酶，固定化蛋白質或酶用緩沖液洗滌，計算固定化效率。
[0010]所述蛋白質或酶，包括脂肪酶，纖維素酶或青霉素G酰化酶。
[0011 ]所述緩沖液為pH 6.0-9.0磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖溶液、檸檬酸鹽緩沖溶液。
[0012]本發明的有益效果如下:
(I)該載體表面有一層松軟的聚多巴胺氧化膜，表面積較大，且制備方法簡單。本發明采用了三種不同的，且形狀各異的蛋白質用于固定化，利用功能化磁性納米粒子作為固定化載體，能夠高效地進行固定化，固定化收率與固定化效率均可高達80-90%。
[0013](2)本發明無需偶聯劑，本發明采用多巴胺鹽酸鹽對磁性油酸納米粒子進行修飾，使磁性納米粒子表面帶有大量的醌基和氨基功能性基團，可直接與蛋白質中游離的氨基發生共價反應，能夠有效地固定化蛋白質；
(3)本發明可用于形狀各異的蛋白質的固定化，適用范圍廣；
(4)本發明可采用多巴胺對其他不同載體表面進行修飾，使其多巴胺功能化，制備出具有不同特性的固定化載體；
(5)本發明較其他固定化方法，減弱了固體載體對蛋白質分子的擺動自由度的限制，提高了固定化酶的活力，具有較好的固定化效率；
(6)本發明提高了蛋白質固定化的收率與效率，且操作簡單。
【附圖說明】
[0014]圖1為實施例1制備的磁性納米粒子Fe3O4OOA與Fe3O4OOAODP的TEM圖。
[0015]圖2為實施例1制備的Fe3O4OOA與Fe3O4OOAODP的紅外分析圖。
[0016]圖3為實施例1的固定化的酶濃度圖。
[0017]圖4為實施例2的固定化的酶濃度圖。
[0018]圖5為實施例3的固定化的酶濃度圖。
[0019]圖中，■為蛋白質固定化收率;?為酶活力回收收率即固定化效率。
【具體實施方式】
[0020]下面結合附圖以及具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不限于此。
[0021]以下實施例所用主要儀器和材料。
[0022]實驗材料:考馬斯亮藍G-250、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三羥甲基氨基甲烷、一水檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鐵(FeCl36H20)、硫酸亞鐵(FeS044H20)、異丙醇、無水乙醇、硝基苯酚(P-NP)、對硝基棕櫚酸酯(p-NPP)、曲拉通(TritonX-100)、多巴胺鹽酸鹽。
[0023]實驗儀器:紫外可見分光光度計(UV-2450/2550，日本島津制作所)、水浴恒溫振蕩器(SHZ-88，江蘇省金壇市醫療儀器廠)、電熱恒溫鼓風干燥箱(Q/BKYY31-2000，上海躍進醫療器械廠)、Thermo Fisher離心機(PIC0-17，美國Thermo Scientific公司)、快速混勾器(SK-1，江蘇省金壇市中大儀器廠)、Genex Beta移液器(DU/DC，上海康敏檢驗設備有限公司)；電子天平(FA1004，上海市安亭電子儀器廠)、集熱式磁力加熱攪拌器(DF-1I，江蘇金壇市醫療儀器廠)、真空干燥箱(DZF-6020，上海一恒科技有限公司)。
[0024]實施例1:固定化脂肪酶<