用于神經肽受體篩選的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及神經膚生物學和動物生理調控、藥物祀標篩選研究技術領域，具體設 及一種用于神經膚受體篩選的方法。
【背景技術】
[0002] 受體相互作用與調控機理的研究開拓了新的思路。神經膚作為神經元間重要的化 學信使，執行神經調質、神經遞質和神經激素的作用。神經膚在動物體廣泛分布，表明生物 學功能具有多樣性和復雜性，主要體現在：1)神經膚數量眾多；2)同一神經膚有多種功能， 且對同一祀器官（祀組織或祀細胞）的效應也不相同；3)同一神經膚隨動物種屬及劑量、 作用部位的不同，功能也不一樣；4)同一神經膚對不同效應細胞作用不同，可產生多種效 應。因此，一直W來，神經膚及其受體的研究受到醫學家、生理學家及分子藥理學家的重視。
[0003] 已發現的神經膚受體中，除屯、房鋼尿膚受體本身具有G蛋白介導的功能外，其它 神經膚受體都屬于G蛋白偶聯的受體，運類受體的特征是受體蛋白的膚鏈跨膜7次并形成 7個α螺旋區段。
[0004] 基于神經膚及其受體一-G蛋白偶聯受體在生理病理過程中的重要生物作用，運 一蛋白家族也是目前最重要的藥物作用祀標庫。因此，篩選神經膚的受體有助于進一步掲 示人類及動物相關疾病的發生發展過程，對新藥物的研制開發和疾病治療具有重大意義。 陽〇化]目前，神經膚受體的篩選多采用傳統的大規模篩選方法，如酵母雙雜交、細菌雙雜 交、蛋白質忍片和免疫親和技術，共同缺點就是實驗過程繁瑣、工作量非常大、費用高，實驗 結果中假陽性、假陰性問題突出，干擾因素多，造成后期受體的確定困難巨大。
【發明內容】
[0006] 為解決上述問題，本發明提供了一種用于神經膚受體篩選的方法。
[0007] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：
[0008] 用于神經膚受體篩選的方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0009] S1、明確要研究的神經膚及其分布組織，采集2組不同生理條件下的該組織，分別 分離神經膚作用的祀細胞，進行轉錄組高通量測序；
[0010] S2、將步驟S1獲得的測序數據設定條件抑R校正后的Ρ< 0. 05,選擇高差異表達 基因（表達差異倍數根據測序數據設定）；
[0011] S3、將步驟S2獲得的差異表達基因應用CEUDV2. 5SubcellularLocalization Prediction數據庫進行亞細胞定位：
[0012] S4、取步驟S3獲得的膜蛋白的FASTA序列，應用HMMT0PV2.0(Predictionof transmembranehelicesandtopologyofproteinsVersion2. 0)篩選 7 次跨膜口 螺方定 區段蛋白，即為G蛋白偶聯受體；
[0013] S5、應用同源建模技術對神經膚和步驟S4中獲得的G蛋白偶聯受體分別建立蛋白 模型并轉化為分子坐標結構：
[0014] S6、根據步驟S5獲得的神經膚和各G蛋白偶聯受體的PDBQT文件，應用ZDOCK V3. 0. 2分子對接技術對神經膚和各G蛋白偶聯受體分別進行模型對接；關鍵技術在于參數 的設定，包括建立受體、配體結合中屯、網格，設定蛋白分子結合距離<6 A,預測結合部位 1，000,評分函數值由高到低，顯示結合構象為前五個預測結果，其它參數軟件自動默認；其 中，受體、配體結合中屯、網格的設定關系到結果的準確性，在設定時，通過實驗研究和查閱 現有資料，確定受體、配體的結合域氨基酸區段；
[0015] S7、將步驟S6中配體和各受體對接的蛋白復合體模型和評分函數輸出，篩選評分 函數值最高的3~5個蛋白復合體，將運3~5個G蛋白偶聯受體作為候選受體；
[0016] S8、將步驟S7所得的G蛋白偶聯受體分別在293T細胞中過表達，巧光標記該神經 膚，通過配體-受體結合實驗最終確定受體。 陽017] 其中，步驟S3的具體步驟為：首先通過NCBI FASTA捜索引擎分別找出每一個Gene symbol的蛋白序列（越完整越好），選擇物種；然后將該基因的FASTA序列輸入CE化0 V2. 5對話框，并對結果進行統計；
[0018] 其中，步驟S5的具體步驟為，采用綜合應用評價體系最為全面的SWISS-M孤化、 Μ孤化L邸和PHYRE2Ξ項同源建模技術，通過評分函數、模型的跨膜折疊數和結合域區域分 布（通過化va軟件實現），對Ξ種建模技術獲得的每一個蛋白的分子模型進行對比評價，選 擇最為可信合理的分子模型并輸出PDBQT文件。
[0019] 本具體實施依據統計學原理，要求基因組測序結果抑RO^lseDiscoveryRate， 錯誤發現率）校正后的P< 0. 05,基因差異表達倍數的選擇依據是受體占領學說一一 配體-受體結合產生的效應強度與占領受體的數量成正比，故在不同組織或細胞轉錄 組中受體與配體表達趨勢相同；采用目前應用較為廣泛，也是蛋白質Ξ維結構預測最 精確的方法一一蛋白同源建模技術建立蛋白模型；同時，綜合應用評價體系最為全面的 SWISS-MODEL版)呢LL邸和PHYRE2Ξ項同源建模技術，避免了單一建模技術造成模型質量 不高的問題；本具體實施在分子對接過程中，各技術參數設定要求明確，對接區域精準，對 接成功后需通過幾何匹配和分子動力學方法優化對接，經相互作用預測臨界評價和分子力 場評價函數獲得對接復合體評分，綜合表達量驗證、神經膚受體的分子特征及功能分析確 定候選受體。
[0020] 本發明具有W下有益效果：
[0021] (1)使用生物信息學技術對神經膚的受體進行規模篩選，減少了繁瑣的實驗室工 作，節約了實驗費用，避免了假陽性、假陰性結果的出現。
[0022] (2)采用本發明方法得到的候選受體數量可控，篩選過程嚴格按照配體-受體的 結構識別理論進行，各技術參數設定要求明確，對接區域精準，分辨率高、準確性和重復性 好，為進一步受體-配體結合實驗確定受體奠定基礎。
【附圖說明】
[0023] 圖1為1331個高差異表達基因CE化0V2. 5蛋白亞細胞定位獲得的188個膜蛋白。
[0024] 圖2為188個膜蛋白HMMT0PV2.0跨膜α螺旋區預測獲得的38個G蛋白偶聯受 體。
[00巧]圖中，橫坐標為跨膜螺旋區數量，縱坐標為蛋白數量。
[00%] 圖3為經評分函數、模型的跨膜折疊數和結合域區域分布選擇，利用SWISS-M孤化 建立的CART模型（將PDBQT文件輸入化va軟件實現）可信合理，左圖為立體模型，右圖為 分子模型（WCART模型為例，其他38個G蛋白偶聯受體模型略）。
[0027] 圖4為SWISS-M孤化建立的CART模型的質量評價曲線，橫坐標為對應的氨基酸殘 基，縱坐標為評分值，要求所構建模型的每一個氨基酸殘基的評分最好為正值，否則表明該 氨基酸殘基在模型中的空間位置不可信合理。
[0028] 圖5為CART與TEDDM1分子對接后形成的蛋白復合體模型。
【具體實施方式】
[0029] 為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，W下結合實施例對本發明進行進一步 詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發明，并不用于限定本發 明。 陽〇3〇] 實施例1
[0031] 用本發明的方法篩選牛卵泡可卡因-苯丙胺調節轉錄膚（Cocaine-and Amphetamine-RegulatedTranscript,CART)的候選受體，義用如下步驟：
[0032]S1、選取8頭