髓過氧化物酶、脂蛋白磷脂酶a2定量聯檢試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領域，具體涉及一種高靈敏度髓過氧化物酶、脂蛋白磷脂酶A2定量聯檢試紙條。
【背景技術】
[0002]髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，ΜΡ0)又稱為過氧化酶，是一種重要的含鐵溶酶體，存在于髓系細胞(主要是中性粒細胞和單核細胞)的嗜天青顆粒中，是髓細胞的特異性標志。人們于1967年第一次認識到ΜΡ0是對外來入侵發生固有免疫反應的組成成分。ΜΡ0是一種血色素蛋白，分子量為118kD，含有一對重鏈和輕鏈，它是在粒細胞進入循環之前在骨髓內合成并存在于嗜天青顆粒內，外界刺激可導致中性粒細胞聚集，釋放ΜΡΟ。ΜΡ0參與多種疾病的發生，如:炎癥、多發性硬化、血管炎和動脈粥樣硬化等。在特定條件下，ΜΡ0催化反應生成過量的氧化劑，超過局部抗氧化劑的防御反應時，就會導致氧化應激和氧化性組織損傷，ΜΡ0通過多種途徑調節炎癥反應，最重要的是通過調節一氧化氮對血管信號傳遞和舒張的作用，直接改變血管的炎癥反應性。
[0003]冠心病(coronary heart disease，CHD)是冠狀動脈發生粥樣硬化，發生痙攣、斑塊破裂及血栓形成導致管腔阻塞，引起冠狀動脈供血不足、心肌缺血或梗死的疾病。研究發現，從穩定性心絞痛(SAP)發展到不穩定性心絞痛(UAP)、再從UAP發展到急性心肌梗死(AMI)是由輕到重的連續變化病理過程，CHD不同病理階段，其動脈粥樣斑塊具有不同的病理特征。研究證實，炎癥反應在動脈粥樣硬化的所有階段均具有重要作用，從脂質條紋形成到易損斑塊破裂。炎性細胞在動脈粥樣硬化早期病變中起支配地位，其效應分子加速病變進展，引起炎癥激活導致易損斑塊破裂，引發ACS。越來越多的臨床研究證據顯示，冠心病病理事件與血清炎癥標志物變化緊密相關，炎癥標志物在冠心病診斷、危險分層、治療及預測中均有重要價值。ΜΡ0是白細胞的功能和激活標志，為中性粒細胞、巨噬細胞分泌的含血紅互輔基的血紅素蛋白酶。臨床和流行病學研究發現，ΜΡ0廣泛參與動脈粥樣硬化的病理過程。Zhang等最早發現冠心病患者ΜΡ0水平高于對照組。Wainstein等進一步研究表明ΜΡ0與CHD嚴重程度相關，在不穩定斑塊在大量中性粒細胞和世噬細胞浸潤及炎性因子表達。
[0004]脂蛋白磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp_PLA2)是磷酯酶A2 (phospholipase A2，PLA2)超家族中的一員，由441個氨基酸殘基組成的一種絲氨酸脂酶，相對分子質量為45.4kD。PLA2是一類能水解磷脂甘油支架Sn_2位上的短鏈酰基的酶族。根據存在的部位、底物特異性、輔助因子的需求和生理學作用等，PLA2主要分為四類:①分泌型胞漿型；③非鈣離子依賴型；④其他:以Lp-PLA2為代表。Lp-PLA2主要由成熟的巨噬細胞和淋巴細胞合成和分泌，并受炎性介質的調節，人循環中的Lp-PLA2以與脂蛋白顆粒結合的形式存在，其中2/3與低密度脂蛋白結合(LDL)，1/3與高密度脂蛋白(HDL)、極低密度脂蛋白VLDL(VLDL)結合。
[0005]Lp-PLA2作為一種新的炎性反應標志物，在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的幾個主要階段中均起著作用。Lp-PLA2主要由巨噬細胞和淋巴細胞產生，在早期的關于Lp-PLA2與As的研究中因Lp-PLA2能水解致炎因子如血小板活化因子(plateletactivating factor, PAF)及結構相關的氧化磷脂，因此曾被認為能抑制炎性反應，甚至能抑制動脈粥樣硬化的形成，故也被稱為血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activatingfactor acetylhydrolase，PAF_AH)。但是近年來的研究已證實Lp_PLA2更大的作用在于促進AS的發生與發展。
[0006]綜上所述，MPO、Lp-PLA2均為炎癥反應標志，都參與了冠狀動脈粥樣硬化作用，兩者的臨床診斷價值不完全相同，聯合檢測可較好地鑒別和診斷CHD不同病理階段，有助于CHD的危險分層，還可以更及時準確診斷心臟狀況，用于心血管疾病的輔助診斷。
[0007]目前國內市場上暫無同類產品。
[0008]生物素-親和素系統(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫學各領域。將該系統應用于免疫組化，酶聯免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術中，可顯著地提高以上技術方法的敏感性、特異性和穩定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進行大規模流行病學調查，成為研究免疫反應的有力工具。由于BAS檢測系統經濟快速，又無放射物質污染，不需復雜儀器，充分顯示了此系統的巨大潛力和應用的可能性。
[0009]生物素-親和素系統檢測原理:BAS是在常規ELISA原理的基礎上，結合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結合常數高達K^M1)。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學特性的一種蛋白質，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結合一個生物素，因幾乎所有用于標記的物質均可以同親和素或鏈霉親合素結合。利用生物素-親和素系統研制髓過氧化物酶、脂蛋白磷脂酶A2定量聯檢快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內容】
[0010]本實用新型的目的，在于提供一種髓過氧化物酶、脂蛋白磷脂酶A2定量聯檢試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側向層析和生物素-鏈霉親和素放大系統，提供高靈敏度髓過氧化物酶、脂蛋白磷脂酶A2定量聯檢試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩定性，降低了非特異性結合，聯合檢測大幅度提高檢測的準確性和便利性，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0011]本實用新型解決其技術問題的解決方案是:髓過氧化物酶、脂蛋白磷脂酶A2定量聯檢試紙條，其包括底板，所述底板上依次設有樣品墊、熒光標記物結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標記物結合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區，所述樣品墊交疊壓在熒光標記物結合墊上，所述熒光標記物結合墊上固定有生物素標記的髓過氧化物酶單克隆抗體、生物素標記的脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體和鏈霉親和素標記的熒光蛋白；所述檢測區內的硝酸纖維素膜上固定有識別髓過氧化物酶另外一個表位的單克隆抗體構成的第一檢測線、識別脂蛋白磷脂酶A2另外一個表位的單克隆抗體構成的第二檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構成的質控線。
[0012]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光標記物結合墊包括層疊的第一熒光標記物結合墊和第二熒光標記物結合墊，所述第一熒光標記物結合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標記物結合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0013]作為上述技術方案的進一步改進，所述第一熒光標記物結合墊中插入樣品墊下方的一端設有定位條，所述樣品墊的下端面設有能容納定位條的定位槽。
[0014]作為上述技術方案的進一步改進，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標記物結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內，所述卡殼殼面上對應于硝酸纖維膜的位置設有觀察窗，卡殼殼面上對應于樣品墊的位置設有加樣孔。
[0015]作為上述技術方案的進一步改進，所述觀察窗為長方形孔。
[0016]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0017]作為上述技術方案的進一步改進，所述樣品墊為經表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構件。
[0018]作為上述技術方案的進一步改進，所述底板為聚苯乙烯構件或者聚乙烯構件。
[0019]作為上述技術方案的進一步改進，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0020]本實用新型與現有技術相比，具有如下優點:
[0021](1)本實用新型將熒光蛋白作為標記物，此標記物穩定性良好，有利于提高檢測穩定性。
[0022](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結合，有利于提高試劑盒性能。
[0023](3)利用本實用新型進行髓過氧化物酶、脂蛋白磷脂酶A2的檢測時間不大于10分鐘，髓過氧化物酶檢測線性范圍為50.0-8000.0pmol/L，脂蛋白磷脂酶A2檢測線性范圍為20.0-1000.0ng/mL，極大地提高了檢測效率。
[0024](4)本實用新型可通過熒光免疫分析儀對結果進行判讀，可實現自動化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結果。
[0025](5)本實用新型卡殼設有樣品進入的加樣孔和供觀測結果的觀察窗，根據分析儀器判定結果，準確可靠。
[0026](6)本實用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0027](7)本實用新型檢測成本較低。
[0028](8)本實用新型可批量生產，適用于臨床快速診斷和現