肌鈣蛋白i、腦鈉肽、d-二聚體定量聯檢試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領域，具體涉及一種高靈敏度肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D- 二聚體定量聯檢試紙條。
【背景技術】
[0002]心肌肌I丐蛋白I (Cardiac troponin I，cTnl)是分子量22.5kD的心肌蛋白，和肌鈣蛋白T(TnT)，肌鈣蛋白C(TnC) —起，形成肌鈣蛋白復合體，從而對細胞內鈣離子信號的傳遞和肌動-肌球蛋白的相互作用起著極其主要的作用，是一種高靈敏度、高特異性的心肌損傷的標志物。1987年英國Cummins等首先報告了測定周圍血中心肌肌I丐蛋白濃度來診斷急性心肌梗死(AMI)，引起了研究者們的廣泛注意，近年來關于心肌肌鈣蛋白的研究初步表明，心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是心臟的特異性抗原，其釋放入血循環是心肌細胞損傷的敏感和高度特異性標志，對某些心血管病的診斷、預告及療效判斷等具有重要意義。1955年美國FDA批準cTnl作為AMI的最新試驗診斷指標。1999年和2000年世界生化檢測標準化協會、歐洲心臟病協會和美國心臟病學會提出了新的AMI定義和診斷標準，把血清標志物檢測，特別是肌鈣蛋白，放在了特別重要的位置。2001年11月美國心臟病學會和心臟病協會提出測定cTnl作為診斷AMI和急性冠狀動脈綜合癥危險分層的第一位標準。在人類心肌損傷的診斷中，cTnl已經成為“金標準”之一。與其他指標相比，cTnl具有在血中出現時間早、持續時間長，且為心肌細胞所特有的優點，所以心肌肌鈣蛋白I在臨床上有著廣泛應用的前景。
[0003]1988年日本學者Tetsuji Sudoh首次從豬腦內分離得到一種具有強力的利鈉、利尿、擴血管和降壓作用的多肽，命名為腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)。以后的研究表明，不只是BNP這一種多肽，而是有一組多肽在生物進化的過程中逐漸發展產生(在人類和脊椎動物至少包括ANP、BNP、CNP、DNP、VNP和Urodilatin)，稱為利鈉肽(NP)家族。其功能是維持循環系統的容量、滲透壓和壓力調節的穩態。目前用于臨床檢測的包括BNP和氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)兩種。在心肌細胞受刺激后，產生初始基因產物前BNP前體(pre-proBNP)，該肽的一個26氨基信號肽被立即去除，形成含108個氨基酸的的BNP前體(proBNP)，后者在內切酶的作用下裂解為含有76個氨基酸、無生物活性的NT-proBNP和含有32個氨基酸、有活性的BNP。BNP主要來源是心室。在正常狀態下，BNP在顆粒中儲存很少，機械性刺激是心室產生及分泌BNP的主要原因。當各種心肌損傷引起心輸出量下降時，反饋性的興奮神經、體液機制，從而使血管收縮、水鈉潴留、心臟前后負荷增加，心肌張力升高，心肌細胞受到牽拉，使心室肌細胞BNP合成與分泌增加，血漿BNP濃度升高。可以產生抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統、抑制交感神經活動、減少水鈉潴留、舒張血管等作用，對心臟有保護作用。因而血液BNP水平的異常變化即可以顯示心臟功能的變化。BNP對心衰的檢測價值近年來已被廣泛接受，現在認為BNP是心衰患者非常有力的診斷和預后的標志物，BNP的檢測也為心功能的分級提供了更加可靠的依據。Wieczorek SJ等比較測定了嚴格按美國紐約心臟病協會(NYHA)心功能分級標準診斷的慢性心衰(CHF)患者血漿BNP水平，心功能I?IV級CHF患者血液BNP濃度均值較正常人明顯增加，且隨心功能的損害程度加重呈顯著上升趨勢。若以100pg/ml為cut off值，BNP對CHF的診斷效能是??敏感度90%，特異性76%。BNP濃度值對于心衰患者的治療效果監測也有幫助，治療有效的患者血液BNP水平較治療前明顯降低。
[0004]D- 二聚體(D-Dimer，簡稱DD)是交聯纖維蛋白的特異降解產物之一，分子量大小約為190kDa，在體內半衰期> 3小時，主要經腎臟排泄。人體纖溶系統對保持血管壁的正常通透性，維持血液的流動狀態和組織修復起著重要作用。正常人纖溶酶和抑制酶之間保持動態平衡，使血液循環能正常進行。機體發生凝血時，凝血酶作用于纖維蛋白原，轉變為交聯纖維蛋白，同時纖溶系統被激活，交聯纖維蛋白溶解過程開始，纖溶酶降解纖維蛋白凝結塊形成各種可溶片段，形成纖維蛋白產物(FDPs)，包括X-寡聚體(X-oligomer)、D-二聚體(D-Dimer)、中間片段(Intermediate fragments)、片段 E (Fragment E)組成。其中，X-寡聚體和D-聚體均含D- 二聚體單位，其中最小、最簡單的降解終產物即是D- 二聚體。1971年Wilson等首先應用纖維蛋白降解產物用于診斷肺動脈栓塞(PE)。隨著研究的開展和深入，臨床工作者對D- 二聚體在肺動脈栓塞中的意義認識日益深刻。1999年歐洲心臟病學會急性肺動脈栓塞診斷和治療指南中推薦用ELISA方法檢測D- 二聚體。陰性的D- 二聚體值對于肺動脈栓塞具有理想的陰性預告作用，陰性的結果可以基本排除肺動脈栓塞，從而可以減少有創的檢查。但是臨床醫生必須清楚它的局限性和應用的指證。D-二聚體的濃度和血栓的位置有關，在肺動脈干主要分支的濃度較高，而在次要分支的濃度較低。在大分支的敏感性為93 %，小分支的敏感性為50 %。雖然D- 二聚體對于小分支血栓的診斷意義不夠明顯，然而其他檢查對于小的血栓同樣不明確，如肺動脈造影等。對于這些小的血栓，只要D-二聚體是陰性的，在患者心肺儲備功能比較好的情況下，可以不采取抗凝治療，臨床隨訪的結果表明這樣做是安全的。D-二聚體在深靜脈血栓(DVT)中總的診斷價值和在PE中的診斷類似價值，陰性的D-二聚體可以基本排除DVT形成的可能。陽性的結果意義不大，特異性不夠強，很多疾病可以引起D- 二聚體的升高。D- 二聚體在DVT診斷中的敏感性為95%，特異性為40%，陽性預測值為48%，陰性預測值為95%。
[0005]綜上所述，cTn1、BNP、DD幾種標志物的臨床診斷價值各不相同，可以從不同的方面反應心肺功能，三項聯合檢測可用于心肺疾病的輔助診斷。
[0006]目前國內市場上暫無同類產品。
[0007]生物素-親和素系統(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫學各領域。將該系統應用于免疫組化，酶聯免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術中，可顯著地提高以上技術方法的敏感性、特異性和穩定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進行大規模流行病學調查，成為研究免疫反應的有力工具。由于BAS檢測系統經濟快速，又無放射物質污染，不需復雜儀器，充分顯示了此系統的巨大潛力和應用的可能性。
[0008]生物素-親和素系統檢測原理:BAS是在常規ELISA原理的基礎上，結合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結合常數高達K^M1)。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學特性的一種蛋白質，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結合一個生物素，因幾乎所有用于標記的物質均可以同親和素或鏈霉親合素結合。利用生物素-親和素系統研制肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D- 二聚體定量聯檢快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內容】
[0009]本實用新型的目的，在于提供一種肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D-二聚體定量聯檢試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側向層析和生物素-鏈霉親和素放大系統，提供高靈敏度肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D-二聚體定量聯檢試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩定性，降低了非特異性結合，聯合檢測大幅度提高檢測的準確性和便利性，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0010]本實用新型解決其技術問題的解決方案是:肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D-二聚體定量聯檢試紙條，其包括底板，所述底板上依次設有樣品墊、熒光標記物結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標記物結合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區，所述樣品墊交疊壓在熒光標記物結合墊上，所述熒光標記物結合墊上固定有生物素標記的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、生物素標記的腦鈉肽單克隆抗體、生物素標記的D- 二聚體單克隆抗體和鏈霉親和素標記的熒光蛋白；所述檢測區內的硝酸纖維素膜上固定有識別心肌肌鈣蛋白I另外一個表位的單克隆抗體構成的第一檢測線、識別腦鈉肽另外一個表位的單克隆抗體構成的第二檢測線、識別D- 二聚體另外一個表位的單克隆抗體構成的第三檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構成的質控線。
[0011]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光標記物結合墊包括層疊的第一熒光標記物結合墊和第二熒光標記物結合墊，所述第一熒光標記物結合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標記物結合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0012]作為上述技術方案的進一步改進，所述第一熒光標記物結合墊中插入樣品墊下方的一端設有定位條，所述樣品墊的下端面設有能容納定位條的定位槽。
[0013]作為上述技術方案的進一步改進，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標記物結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內，所述卡殼殼面上對應于硝酸纖維膜的位置設有觀察窗，卡殼殼面上對應于樣品墊的位置設有加樣孔。
[0014]作為上述技術方案的進一步改進，所述觀察窗為長方形孔。
[0015]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0016]作為上述技術方案的進一步改進，所述樣品墊為經表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構件。
[0017]作為上述技術方案的進一步改進，所述底板為聚苯乙烯構件或者聚乙烯構件。
[0018]作為上述技術方案的進一步改進，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0019]本實用新型與現有技術相比，具有如下優點:
[0020](1)本實用新型將熒光蛋白作為標記物，此標記物穩定性良好，有利于提高檢測穩定性。
[0021](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結合，有利于提高試劑盒性能。
[0022](3)利用本實用新型進行心肌肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D-二聚體的檢測時間不大于10分鐘，心肌肌I丐蛋白I檢