心肺功能五項聯合免疫層析定量聯檢試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領域，具體涉及一種高靈敏度心肺功能五項聯合免疫層析定量聯檢試紙條。
【背景技術】
[0002]心肌肌I丐蛋白I (Cardiac troponin I，cTnl)是分子量22.5kD的心肌蛋白，和肌鈣蛋白T(TnT)，肌鈣蛋白C(TnC) —起，形成肌鈣蛋白復合體，從而對細胞內鈣離子信號的傳遞和肌動-肌球蛋白的相互作用起著極其主要的作用，是一種高靈敏度、高特異性的心肌損傷的標志物。1987年英國Cummins等首先報告了測定周圍血中心肌肌I丐蛋白濃度來診斷急性心肌梗死(AMI)，引起了研究者們的廣泛注意，近年來關于心肌肌鈣蛋白的研究初步表明，心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是心臟的特異性抗原，其釋放入血循環是心肌細胞損傷的敏感和高度特異性標志，對某些心血管病的診斷、預告及療效判斷等具有重要意義。1955年美國FDA批準cTnl作為AMI的最新試驗診斷指標。1999年和2000年世界生化檢測標準化協會、歐洲心臟病協會和美國心臟病學會提出了新的AMI定義和診斷標準，把血清標志物檢測，特別是肌鈣蛋白，放在了特別重要的位置。2001年11月美國心臟病學會和心臟病協會提出測定cTnl作為診斷AMI和急性冠狀動脈綜合癥危險分層的第一位標準。在人類心肌損傷的診斷中，cTnl已經成為“金標準”之一。與其他指標相比，cTnl具有在血中出現時間早、持續時間長，且為心肌細胞所特有的優點，所以心肌肌鈣蛋白I在臨床上有著廣泛應用的前景。
[0003]1988年日本學者Tetsuji Sudoh首次從豬腦內分離得到一種具有強力的利鈉、利尿、擴血管和降壓作用的多肽，命名為腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)。以后的研究表明，不只是BNP這一種多肽，而是有一組多肽在生物進化的過程中逐漸發展產生(在人類和脊椎動物至少包括ANP、BNP、CNP、DNP、VNP和Urodilatin)，稱為利鈉肽(NP)家族。其功能是維持循環系統的容量、滲透壓和壓力調節的穩態。目前用于臨床檢測的包括BNP和氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)兩種。在心肌細胞受刺激后，產生初始基因產物前BNP前體(pre-proBNP)，該肽的一個26氨基信號肽被立即去除，形成含108個氨基酸的的BNP前體(proBNP)，后者在內切酶的作用下裂解為含有76個氨基酸、無生物活性的NT-proBNP和含有32個氨基酸、有活性的BNP。BNP主要來源是心室。在正常狀態下，BNP在顆粒中儲存很少，機械性刺激是心室產生及分泌BNP的主要原因。當各種心肌損傷引起心輸出量下降時，反饋性的興奮神經、體液機制，從而使血管收縮、水鈉潴留、心臟前后負荷增加，心肌張力升高，心肌細胞受到牽拉，使心室肌細胞BNP合成與分泌增加，血漿BNP濃度升高。可以產生抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統、抑制交感神經活動、減少水鈉潴留、舒張血管等作用，對心臟有保護作用。因而血液BNP水平的異常變化即可以顯示心臟功能的變化。BNP對心衰的檢測價值近年來已被廣泛接受，現在認為BNP是心衰患者非常有力的診斷和預后的標志物，BNP的檢測也為心功能的分級提供了更加可靠的依據。Wieczorek SJ等比較測定了嚴格按美國紐約心臟病協會(NYHA)心功能分級標準診斷的慢性心衰(CHF)患者血漿BNP水平，心功能I?IV級CHF患者血液BNP濃度均值較正常人明顯增加，且隨心功能的損害程度加重呈顯著上升趨勢。若以100pg/ml為cut off值，BNP對CHF的診斷效能是??敏感度90%，特異性76%。BNP濃度值對于心衰患者的治療效果監測也有幫助，治療有效的患者血液BNP水平較治療前明顯降低。
[0004]D- 二聚體(D-Dimer，簡稱DD)是交聯纖維蛋白的特異降解產物之一，分子量大小約為190kDa，在體內半衰期> 3小時，主要經腎臟排泄。人體纖溶系統對保持血管壁的正常通透性，維持血液的流動狀態和組織修復起著重要作用。正常人纖溶酶和抑制酶之間保持動態平衡，使血液循環能正常進行。機體發生凝血時，凝血酶作用于纖維蛋白原，轉變為交聯纖維蛋白，同時纖溶系統被激活，交聯纖維蛋白溶解過程開始，纖溶酶降解纖維蛋白凝結塊形成各種可溶片段，形成纖維蛋白產物(FDPs)，包括X-寡聚體(X-oligomer)、D-二聚體(D-Dimer)、中間片段(Intermediate fragments)、片段 E (Fragment E)組成。其中，X-寡聚體和D-聚體均含D- 二聚體單位，其中最小、最簡單的降解終產物即是D- 二聚體。1971年Wilson等首先應用纖維蛋白降解產物用于診斷肺動脈栓塞(PE)。隨著研究的開展和深入，臨床工作者對D- 二聚體在肺動脈栓塞中的意義認識日益深刻。1999年歐洲心臟病學會急性肺動脈栓塞診斷和治療指南中推薦用ELISA方法檢測D- 二聚體。陰性的D- 二聚體值對于肺動脈栓塞具有理想的陰性預告作用，陰性的結果可以基本排除肺動脈栓塞，從而可以減少有創的檢查。但是臨床醫生必須清楚它的局限性和應用的指證。D-二聚體的濃度和血栓的位置有關，在肺動脈干主要分支的濃度較高，而在次要分支的濃度較低。在大分支的敏感性為93 %，小分支的敏感性為50 %。雖然D- 二聚體對于小分支血栓的診斷意義不夠明顯，然而其他檢查對于小的血栓同樣不明確，如肺動脈造影等。對于這些小的血栓，只要D-二聚體是陰性的，在患者心肺儲備功能比較好的情況下，可以不采取抗凝治療，臨床隨訪的結果表明這樣做是安全的。D-二聚體在深靜脈血栓(DVT)中總的診斷價值和在PE中的診斷類似價值，陰性的D-二聚體可以基本排除DVT形成的可能。陽性的結果意義不大，特異性不夠強，很多疾病可以引起D- 二聚體的升高。D- 二聚體在DVT診斷中的敏感性為95%，特異性為40%，陽性預測值為48%，陰性預測值為95%。
[0005]肌紅蛋白(Myoglobin，ΜΥ0)是一種氧結合血紅素蛋白，其分子量為16.7KD，主要分布于心肌和骨骼肌組織，呈緊密球形。其本質是由一條肽鏈和一個血紅素輔基組成的結合蛋白，由153個氨基酸殘基組成，含有血紅素，與血紅蛋白同源，跟氧的結合能力介于血紅蛋白和細胞色素氧化酶之間，可幫助肌細胞將氧轉運到線粒體。能可逆地與氧結合，是一種氧合結合蛋白，參與葡萄糖氧化，在細胞內主要具有運輸氧和儲氧功能。與氧的親和力比血紅蛋白強，在極低的氧張力情況下，肌肉缺氧時，可以釋放出氧供肌肉收縮的急需，還能緩沖細胞內氧濃度，使細胞內氧濃度相對穩定。其對于維持正常的肌肉發育和功能是必需的；結合并清除N0，其過氧化物酶活性可以調節細胞內氧化還原狀態，清除活性氧。由于ΜΥ0分子量小，容易釋放入外周血，因而ΜΥ0是即時的最易檢出的心肌壞死時的生化標志物，在心肌受損后3小時即可出現在外周血中，ΜΥ0正常參考值為20-80ng/ml，在急性心肌損傷時，ΜΥ0最先被釋放入血液中，在癥狀出現約2-3小時后，血中ΜΥ0可超出正常上限，升高幅度超過150ng/ml或增幅大于25%，4_8小時升高可達900ng/ml以上，9_12小時升至峰值，峰值為參考值10-30倍，24-48小時恢復正常。如峰值期持續時間較長，超過24小時，恢復正常緩慢，超過4天以上，或下降過程再度升高形成雙峰、多峰，則提示可能發生心梗延展或新的部位又發生心梗。升高程度及持續時間與心梗預后密切相關，其中峰值升高顯著，在血液中持續72-96小時的患者預后不良，死亡率較高；而峰值低，發病24小時即恢復正常的，預后良好。在急性心肌梗塞患者血清肌紅蛋白早期出現峰值，可指示心肌梗塞的大小和估計梗塞的擴展；在穿透性心肌梗塞患者血清肌紅蛋白濃度要高于心內膜下急性心肌梗塞患者；在急性心肌梗塞患者病情惡化時，其血清肌紅蛋白濃度可再度升高；急性心肌梗塞患者如其血清肌紅蛋白濃度反復增高，則提示原有心肌梗塞還在擴展。
[0006]肌酸激酶(Creatinekinase，CK)舊稱為肌酸磷酸激酶(Creatinephosphokinase，CPK)。CK分子量為81000，由兩個亞基組成。通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉磷酰基反應。CK在ATP參與下催化肌酸磷酸化，生成ATP和磷酸肌酸。肌酸激酶有四種同功酶形式:肌肉型(CK-MM)、腦型(CK-BB)、雜化型(CK-MB)和線粒體型(CK-MiMi)。CK-MM型主要存在于各種肌肉細胞中，CK-BB型主要存在于腦細胞中，CK-MB型主要存在于心肌細胞中，CK-MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌線粒體中。CK-MB在傳統心肌酶學中曾作為診斷AMI的金標準，然而25% -50%的AMI患者在發