一種用于膀胱癌的檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型涉及醫學檢驗領域，具體涉及一種用于膀胱癌的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 膀胱癌是中國泌尿生殖系最常見的惡性腫瘤，近年來其發病率仍呈上升趨勢。早 期診斷患者的預后良好，術后5年生存率可達94%。
[0003]膀胱癌的診斷主要依賴膀胱鏡檢查和尿液脫落細胞學檢查。膀胱鏡檢是膀胱癌診 斷的主要手段，但侵入性檢查導致患者痛苦大，依從性差，且費用較高，可發生尿道感染、出 血等并發癥，約有10%的病灶被漏診，且其診斷原位癌的敏感度很低。尿細胞學是膀胱癌診 斷和術后隨診的主要方法之一，但檢查結果回報慢，且受檢查員的主觀影響大，其診斷膀胱 癌敏感度僅為35%，易產生假陽性，據推測，尿液脫落細胞學檢查會漏診約60%的高級別 膀胱癌。
[0004]國內外很多研究致力于尋找更理想的膀胱癌早期診斷標志物，以期減少膀胱鏡的 使用，并補充、替代尿液脫落細胞學檢查，以提高診斷準確性，協助疾病風險評估，監測腫瘤 的惡性程度，預測腫瘤進展，使膀胱癌的診斷更為準確、經濟。
[0005] 目前發現的主要膀胱癌腫瘤標志物包括BAT、NMP22、FDP、CK、EpCAM等。
[0006] BAT(膀胱腫瘤抗原）又被稱為補體因子H相關蛋白，對膀胱腫瘤診斷的準確率中 等，易隨尿液狀態的改變而出現假陽性，如濃縮尿、血尿、行侵入性檢查及經BCG治療后。還 不能代替尿細胞學檢查，也不能單獨應用于膀胱癌診斷。
[0007] NMP22(核基質蛋白22)可用于膀胱癌的早期篩查，但假陽性率較高，泌尿系統感 染、結石、前列腺增生、放療、BCG治療、泌尿系腔內器械操作等均會增加NMP22的假陽性率， 減弱了NMP22的臨床實用性。
[0008] FDP(纖維蛋白降解產物），膀胱癌的臨床分期越高，尿FDP的濃度越高，尿FDP水 平檢測對判斷膀胱癌的復發具有參考價值，可以用于膀胱癌的診斷及是否復發的判斷。高 分級的腫瘤更易引起FDP的漏檢，所以FDP對高分級的腫瘤預測價值更好。
[0009]CK(細胞角蛋白），與膀胱癌診斷、檢測復發及預后關系最相關的主要有CK19、 CK20,需通過外周血檢測，可監測腫瘤轉移、復發。
[0010] EpCAM(Epithelialcelladhesionmolecule，上皮細胞黏附分子），膀胱癌患者 EpCAM含量與正常對照組相比明顯升高，且EpCAM含量的升高對于分級為3級及以上和T2+ 膀胱癌具有特異性。
[0011] 以上膀胱癌腫瘤標記物中，通過對EpCAM蛋白進行檢測，不僅可以實現膀胱癌的 快速靈敏診斷，而且針對EpCAM蛋白檢測，可以檢測膀胱癌的侵略性水平，對患者的診斷和 病情風險分級具有極大的臨床應用價值。 【實用新型內容】
[0012] 本實用新型需要解決的現有技術的問題是：現有的用于膀胱癌檢測的試劑盒，只 用于檢測是否患有癌癥，無法確定癌癥侵略性水平，而且檢測靈敏度和特異性低。
[0013] 為了解決上述問題，本實用新型提供了如下技術方案：
[0014] 本實用新型提供了一種用于膀胱癌的檢測試劑盒，包括設有凹槽的盒體1，其特征 在于：所述盒體1內設置有酶標板2和試劑瓶3;
[0015] 所述酶標板2包括包被有抗EpCAM抗體的反應槽21;
[0016] 所述試劑瓶3包括酶標瓶、抗EpCAM標記抗體瓶。
[0017] 優選的，所述酶標瓶為辣根過氧化物酶標記的親和素酶標瓶。
[0018] 優選的，所述反應槽的數量為96或48個。
[0019] 優選的，所述試劑瓶3還包括標準品瓶、稀釋液瓶、洗滌液瓶、底物液瓶和終止液 瓶。
[0020] 優選的，所述底物液瓶包括顯色液A瓶和顯色液B瓶。
[0021] 優選的，所述酶標瓶：抗EpCAM標記抗體瓶：所述稀釋液瓶：洗滌液瓶：終止液瓶： 顯色液A瓶：顯色液B瓶：標準品瓶的容積比為：5-10:5-10:10-20:30-50:5-10:5-10:5-10 :1-2〇
[0022] 優選的，所述酶標瓶的容積為5-10ml、抗EpCAM標記抗體瓶的容積為5-10ml、所 述稀釋液瓶的容積為10_20ml、所述洗滌液瓶的容積為30-50ml、所述終止液瓶的容積為 5-10ml、所述顯色液A瓶的容積為5-10ml、所述顯色液B瓶的容積為5-10ml、所述標準品瓶 的容積為l_2ml。
[0023] 本試劑盒的檢測原理為：采用抗體-抗原-抗體雙抗體夾心法對膀胱癌的腫瘤標 記物EpCAM蛋白進行檢測，檢測相抗體經生物素（biotin)標記。樣品和生物素標記的抗體 先后加入酶標板的反應槽反應后，采用PBST洗滌。隨后加入辣根過氧化物酶（HRP)標記的 鏈霉親和素反應；經過PBST的徹底洗滌后用底物3, 3'，5, 5'-四甲基聯苯胺（TMB)顯色。 TMB在辣根過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，其顏色的 深淺和樣品中的待測因子呈正相關。
[0024] 其中，所述酶標板、試劑瓶的數量和容積不受限制，可根據實際需要進行調整。
[0025] 采用不同濃度的EpCAM抗體標準品進行定量測定，根據不同濃度標準品和樣品檢 測的結果，進行線性范圍的計算得到檢測范圍，EpCAM的檢測范圍為25pg/ml~1000pg/ml。 選用不含EpCAM的空白樣本，測定均值和標準差，計算EpCAM的檢測限為lpg/ml。
[0026] 本實用新型的有益效果是：
[0027] (1)本試劑盒通過檢測結果可以判斷癌癥侵略性水平，即惡性程度，指導醫生進行 檢查和治療，有助于調整和加快患者治療。
[0028] (2)本試劑盒靈敏度高，早期診斷不漏診，防止治療延誤，可以用于對新發患者進 行檢測，也可以用于對復發患者進行檢測。
[0029] (3)使用尿液作為檢測標本，具有采集方便，操作無創，采集的標本量大，易獲得對 照人群的標本等優勢。
[0030] (4)酶聯免疫法技術操作簡便，結果回報快，費用低。
[0031]下面結合附圖和各個【具體實施方式】，對本實用新型及其有益技術效果進行詳細說 明。
【附圖說明】
[0032]圖1為實施例一的用于膀胱癌的檢測試劑盒的結構示意圖，其中，1為盒體，2為酶 標板，3為試劑瓶。
[0033] 圖2為實施例一所述的試劑盒內部結構的俯視圖，其中12為酶標板槽，13為試劑 瓶槽。
[0034]圖3為實施例一所述的試劑盒的酶標板的結構示意圖，其中21為反應槽。
【具體實施方式】
[0035] 如上所述，本實用新型的目的在于：提供一種用于膀胱癌檢測的試劑盒，實現膀胱 癌的高靈敏度和高特異性檢測，不僅用于膀胱癌的檢測，同時用于檢測膀胱癌的侵略性水 平。
[0036] 下面結合附圖和實施例對本實用新型作進一步詳細的說明。其中，實施例中，所用 各試劑的廠家如下：
[0037] EpCAM標準品，廠家：上海華壹生物科技有限公司
[0038] 抗EpCAM多克隆抗體，廠家：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司
[0039] 生物素標記試劑盒，廠家：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司
[0040] 鏈酶親和素-HRP，廠家：上海華壹生物科技有限公司
[0041] 3, 3'，5, 5'，-四甲基聯苯胺（TMB)，廠家：上海華壹生物科技有限公司，作為實施 例中的底物液A和底物液B用。
[0042]牛血清白蛋白（BSA)，廠家：天津希恩思生化科技有限公司
[0043] 聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯（TWEEN20,吐溫20)，廠家：天津開發區樂泰化工有 限公司
[0044] 磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、濃硫酸等常用試劑 均購自于天津市科密歐化學試劑有限公司
[0045] 其中，各試劑的配制方法如下：
[0046] 1)稀釋液（PBS):氯化鈉8g，氯化鉀0? 2g，磷酸氫二鈉2. 7g，磷酸二氫鉀0? 2g，加 蒸饋水至l〇〇〇ml，pH:7. 4。
[0047] 2)包被液（0. 05M碳酸鹽緩沖液）：碳酸鈉1. 59克，碳酸氫鈉2. 93克，加蒸餾水至 1000ml，pH9. 6〇
[0048] 3)洗滌液（PBST):含0. 05 %吐溫-20的PBS溶液（1LPBS中加入 500ylTween-20,充分混勻）。
[0049] 4)封閉液：牛血清白蛋白（BSA) 5克，加洗滌緩沖液至100ml。
[0050] 5)終止液：雙蒸水180ml，加濃硫酸至200ml。
[0051]6)生物素標記EpCAM抗體：按照生物素標記試劑盒的操作步驟，制備得到生物素 標記的抗EpCAM抗體。
[0052] 實施例一
[0053]一、試劑盒
[0054] 實施例一提供了一種用于膀胱癌的檢測試劑盒，所述試劑盒包括帶有凹槽的盒 體1，所述盒體1內設置有酶標板2和放置于凹槽上的試劑瓶3,所述酶標板包括包被有抗 EpCAM的多克隆抗體的反應槽21，所述試劑瓶3包括酶標瓶、抗EpCAM標記抗體瓶，如圖1 所示。所述試劑盒的內部結構的俯視圖，如圖2所示，其中12為酶標板槽，13為試劑瓶槽， 分別用于放置酶標板和試劑瓶。
[0055] 其中，所述試劑盒含酶標瓶1瓶，其容積為10ml，其中裝有辣根過氧化物酶標記的 鏈酶親和素8ml。