快速檢測大豆凝集素的膠體金免疫層析試紙的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型涉及一種快速檢測大豆凝集素 SBA的膠體金免疫層析試紙。
【背景技術】
[0002] 大豆中蛋白質含量豐富，一般為35°/『38%，氨基酸組成平衡，且富含不飽和脂肪酸， 是人體和動物體重要的植物蛋白和植物油來源。由于其種植面積廣，產量大，長久以來一直 被廣泛應用于食品和飼料的加工原料，對于人類健康和動物營養具有極高的使用價值。然 而，大豆中也含有多種抗營養因子，這些抗營養因子在很大程度上影響了大豆的開發與利 用。大豆凝集素（SBA)是大豆中主要抗營養因子之一，也是大豆中唯一的含量較高的生物 活性蛋白。SBA是能夠特異結合N-乙酰基D-半乳糖胺/D-半乳糖，分子量約120kD的一類 糖蛋白，其抗營養作用主要表現在：對動物生長的抑制作用，影響營養物質的消化吸收，影 響的小腸結構及功能，促進胰腺增生，觸發肥大細胞脫粒和暫時性過敏反應等。這些抗營養 作用對于人類和動物尤其是幼齡動物的生長和健康造成潛在危害，因此，建立一種快速、靈 敏、準確的檢測食品及飼料中的大豆凝集素含量的方法具有重要意義。
[0003] 大豆凝集素是一種大分子蛋白，可以利用SBA抗體通過免疫學的方法對其含量進 行檢測。目前國內外應用較為廣泛的免疫學檢測方法包括火箭免疫電泳、酶聯免疫吸附法 和功能性凝集素免疫測定法等。免疫層析試紙檢測方法相對于其他免疫學檢測方法更為快 速，且具有成本低、便攜、易操作等優點，可以用于大批量樣品的定性與定量檢測，在準確性 和靈敏度上也能夠滿足要求。該法分析過程簡單，用作SBA的檢測有獨特優勢，是需要優先 發展的檢測技術。但目前仍沒有關于SBA免疫層析試紙檢測方法的報道，所以該方法將會 成為未來大豆抗營養因子檢測方法的一個發展方向。 【實用新型內容】
[0004] 本實用新型要解決的技術問題：針對現有技術存在的不足，提供一種特異、靈敏、 簡便、安全、快速檢測SBA的免疫層析試紙。
[0005] 本實用新型的技術方案：
[0006] -種快速檢測SBA的膠體金免疫層析試紙，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護 層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為樣品墊、結合墊、纖維素膜和吸水墊。在纖維素 膜設有用SBA兔源多克隆抗體溶液噴點的檢測線以及用羊抗小鼠 IgG抗體或兔抗小鼠 IgG 抗體溶液噴點的質控線；所述結合墊吸附有膠體金納米顆粒標記的SBA鼠源單克隆抗體。
[0007] 所述支撐層用不吸水的韌性材料制成；樣品墊用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙 烯膜或聚酯膜制成；結合墊用玻璃纖維棉、聚酯膜、醋酸纖維或尼龍膜制成；纖維素膜用硝 酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；吸水墊用吸水濾紙或濾油紙制成。纖維素膜 上的隱形檢測線和隱形質控線為平行排列的" I I "直線式，或為其他類似印記。
[0008] 快速檢測SBA的膠體金免疫層析試紙的制備方法：包括用膠體金納米顆粒標記的 SBA鼠源單克隆抗體(金標單抗)制備結合墊，用SBA兔源多克隆抗體溶液噴點隱形檢測線， 用羊抗小鼠 IgG抗體或兔抗小鼠 IgG抗體溶液噴點隱形質控線，然后在支撐層上黏貼樣品 墊、結合墊、纖維素膜和吸水墊。在所述樣品墊、結合墊及吸水墊上覆蓋有保護膜，在樣品墊 與結合墊交界處對應的保護膜上噴點有樣品標記線，最后加上保護層。
[0009] 該試紙利用了雙抗體夾心檢測抗原的原理，當試紙測試端插入待測樣品溶液后， 待測溶液通過虹吸作用帶動待測SBA及結合墊中的金標單抗一起向纖維素膜擴散，并最終 滲入手柄端的吸水材料層。在擴散過程中，待測SBA可先與金標單抗相結合，進而與纖維素 膜上噴點的兔源多克隆抗體檢測線結合，金標抗體和兔源多克隆抗體分別與樣品中被檢測 的SBA分子上的不同抗原決定簇結合，SBA被夾在金標單抗和兔源多克隆抗體之間，形成金 標單抗-抗原-兔源多抗復合物，即雙抗體夾心模式，顯示紅色檢測印記" I ";纖維素膜上 噴點的羊或兔抗小鼠 IgG抗體質控線也可與金標抗體結合，形成紅色質控印記" I "，即兩 條紅色印記" I Γ表示為陽性；反之樣品溶液中無 SBA時，則不能與金標抗體結合，同樣也 不能與纖維素膜上噴點的兔源多克隆抗體檢測線結合，不顯示紅色檢測印記，而纖維素膜 上噴點的羊或兔抗小鼠 IgG抗體質控線可與金標抗體結合，顯示紅色質控線印記" I "，形 成一條紅色印記" I "表示為陰性。無論結果為陽性還是陰性，都會顯示紅色質控印記，若 不顯示則表示試紙失效。
[0010] 本實用新型的積極有益效果：
[0011] (1)特異性強，靈敏度高。本實用新型試紙以雙抗體夾心原理為基礎制備而成， 兩種抗體分別為膠體金納米顆粒標記的鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體。金標抗體中 金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標 記對抗體的特異性及親和力影響很小，且具有較高的標記率。試驗表明，該試紙具有較 高的靈敏度，可檢測l〇〇ng/mL的微量SBA ;用該試紙檢測分別檢測高濃度的glycinin、 β -conglycinin、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子和大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子， 濃度為20 μ g/mL，結果檢測線均不顯色，說明該試紙與這幾種大豆蛋白均沒有交叉反應，具 有良好的特異性。
[0012] (2)簡便、快速。使用本實用新型試紙，無需其他任何試劑和儀器，可現場操作。只 需將試紙插入被檢樣品液中，IOmin后即可判定檢測結果。
[0013] (3)結果顯示形象、直觀、準確。本實用新型試紙以顯示紅色印記" I I "和" I " (或類似性狀）作為檢測的陽性和陰性標記，即在纖維素膜上顯示兩條紅色印記" I I "（檢 測線和質控線)，表示被檢樣品中含有SBA ;顯示一條紅色印記" I "(質控線)，表示被檢樣品 中不含SBA。此結果可用肉眼直接觀測，判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陽性和 假陰性等人為誤判。
[0014] (6)節省費用。適用于進行現場檢測，費用低廉，節省大量貴重儀器及設備費用。
[0015] (7)適用范圍廣，便于推廣應用。本實用新型實現了基于雙抗體夾心的原理在快速 檢測SBA膠體金免疫層析試紙中的應用，該試紙操作簡便，能滿足不同層次人員的需要，包 括海關檢疫、衛生檢疫、質量監測、農畜產品生產企業和飼料加工企業等。本實用新型在保 障食品安全、保護對于大豆過敏的消費者健康以及保障畜禽飼料安全等方面具有極其重要 的意義，將具有明顯的經濟效益和社會
[0016] 效益。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本實用新型的免疫層析試紙的結構示意圖。
[0018] 圖2為本實用新型的免疫層析試紙的俯視結構示意圖。
[0019] 圖中，1為支撐層，2為樣品墊，3為結合墊，4為纖維素膜，5為吸水墊，6為檢測線， 7為質控線，8-1為測試端保護膜，8-2為手柄端保護膜，9為樣品標記線。
【具體實施方式】
[0020] 以下實施例是為了更好的解釋本實用新型，但并不表示對本實用新型的特別限 定，如果沒有特別說明，其中的百分含量均可理解為重量百分比。
[0021] 本實用新型試紙的制備過程包括：SBA兔源多克隆抗體的制備、SBA鼠源單克隆抗 體的制備、結合墊的制備、樣品墊的制備、纖維素膜的制備和試紙的組裝等步驟。
[0022] 1、SBA兔源多克隆抗體的制備：
[0023] 取清潔級3月齡新西蘭大白兔，用SBA溶液進行免疫，頸部皮下分4~6點注射。首 次免疫劑量為20(^g/只，用無菌PBS稀釋SBA與等量弗氏完全佐劑（FCA)混合，25000r/ min充分乳化IOmin ;加強免疫劑量增大，為30(^g/只，免疫4次，用無菌PBS稀釋SBA與等 量弗氏不完全佐劑（FIA)混合，25000r/min充分乳化lOmin。共免疫4次，每次免疫間隔3 周，最后一次免疫30天后，以ELISA法測定效價，并鑒定其敏感性和特異性，心臟采血并分 離收集血清。以飽和硫酸銨鹽析法純化兔源多克隆抗體，即取1份血清加2份PBS(pH7. 2) 混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、1000 Orpm離心30min，棄上清， 再以適量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33 %，置4°C冰箱12h，4°C、 1000 Orpm離心30min，棄上清，以適量PBS (ρΗ7· 2)溶解沉淀，置4°C冰箱內用PBS (ρΗ7· 2) 透析48~72h，中間換液6~8次，4°C、12000rpm離心15min，收集上清，得初步純化的SBA兔 源多克隆抗體。
[0024] 然后采用Protein G親和層析柱進行進一步純化，先用10倍柱體積的PBS起始 緩沖液平衡層析柱，將初步純化的SBA兔源多克隆抗體用起始緩沖液1:1稀釋后，通過 0. 22 μm-次性無菌過濾器過濾后加樣，隨后用10倍柱體積的起始緩沖液流洗，除去未結 合抗體，最后用2倍柱體積的洗脫緩沖液（0. lmol/L甘氨酸-鹽酸，pH 2. 5)洗脫，用盛有中 和液（0. lmol/L Tris-HCl pH 9.0)的離心管收集，再用PBS充分透析備用。
[0025] 2、SBA鼠源單克隆抗體的制備：
[0026] 取SPF級6~8周齡BALB/c小鼠，用SBA溶液進行免疫。劑量為5(^g/只，背部皮 下分4~6點注射。免疫4次，首次免疫用無菌PBS稀釋SBA與等量FCA混合，加強免疫用無 菌PBS稀釋SBA與等量FIA混合，25000r/min充分乳化lOmin，免疫間隔3周。確定抗體效 價符合要求后以5(^g/只的劑量不加佐劑進行超強免疫，之后3~4天將免疫小鼠眶下竇采 血，分離陽性血清；脫頸致死，用75%的酒精浸泡小鼠5~10min消毒體表，無菌操作取其脾 臟，將脾臟剪碎并研磨，經120目尼龍紗布過濾，1000 rpm離心10min，收集脾細胞。將I X IO8的脾細胞與NSO骨髓瘤細胞按10:1的比例混合，1000 rpm離心10min，棄上清，細胞沉淀物 于37°C水浴中緩慢加入0. 7~1. OmL的PEG1500作用lmin，然后緩慢加入無血清1640培養 基15mL，以終止PEG的作用；37°C水浴靜置5min，1000 rpm離心10min棄上清，將細胞沉淀 物重懸于HAT選擇培養基中，并加入96孔細胞培養板孔（10〇μL^20〇μL7孔)，置于37°C、5% 的CO2培養箱中培養。培養10~14天，用間接ELISA和間接競爭ELISA法進行陽性孔篩選， 選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行2~3次有限稀釋