心臟型脂肪酸結合蛋白免疫層析定量檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領域，具體涉及一種高靈敏度心臟型脂肪酸結合蛋白免疫層析定量檢測試紙條。
【背景技術】
[0002]脂肪酸結合蛋白(Fatty acid binding protein，FABP)是多種功能相同的小分子蛋白家族，主要存在于大量耗能的細胞胞質，在細胞內脂肪代謝中起轉運游離脂肪酸的作用。最先于心肌中發現的FABP又稱為心臟型脂肪酸結合蛋白(heart-type fattyacid-binding protein，簡稱H-FABP)，是一種低分子量的心肌細胞楽非酶類蛋白，分子量為14500D，由132個氨基酸殘基組成，其分子結構與免疫學特性不同于其他類型的FABP，具有心肌特異性。
[0003]目前臨床常用的診斷AMI的標志物有CK-MB、Mb、心肌肌鈣蛋白(cardiactroponin, cTn)等，現有心肌標志物在靈敏度和特異度方面往往不能兼顧。cTn1、cTnT是迄今發現的最特異的心肌標志物，然而cTn升高相對較晚并持續較長時間，其在AMI早期診斷以及反映心肌再梗死中的價值仍然受限。以上心肌標志物的缺點使AMI的早期診斷變得比較困難。隨著H-FABP的發現及其在AMI診斷領域的引入，這種情況可能會得到改善。作為一種新的AMI的標志蛋白，近年來H-FABP日益受到重視和關注。
[0004]H-FABP能及早發現超急期AMI患者。對于鑒別出需急診住院、冠狀動脈造影、介入治療的患者有很高的敏感性，尤其那些胸痛發病6h內的患者的早期診斷和預后判斷有很大幫助。H-FABP如與傳統的標記物cTn1、CK-MB結合起來一起檢測，早期檢測H-FABP，恢復期檢測cTnl，有利于篩選出有心臟疾患高風險的患者，不僅方便采取積極的治療策略，還可節約患者開支和實驗室資源，H-FABP與cTnl合理互補監測也許是將來一種臨床診治缺血性心臟病的理想選擇。
[0005]目前檢測心臟型脂肪酸結合蛋白的常用方法有:
[0006]I膠乳凝集法
[0007]膠乳凝集法是臨床較常用的血清學方法，屬于間接的凝集試驗。膠乳試劑用純化的抗人H-FABP抗體致敏，能和病人血清中H-FABP發生特異性反應，數分鐘內呈現清晰的凝集顆粒，出現凝集者為陽性，未出現凝集者為陰性。此方法操作簡單、快速，敏感性、特異性較高。但易受補體、類風濕因子(RF)等因素的干擾，產生假陽性結果。因此，為了提高結果的準確性，檢測時應對待測標本進行預處理，以去除干擾因素。
[0008]2免疫透射比濁法
[0009]免疫透射比濁法是實驗室常用檢測方法。免疫透射比濁法也是一種微量的免疫沉淀測定法。其與速率散射比濁法不同的是以測定透過溶液的光量來反映待測抗原的含量。當光線透過反應體系時，溶液中的抗原抗體免疫復合物可對光線加以吸收和反射，使透射光減少。免疫復合物越多，吸收的光線越多，透射光越少，這種變化可用吸光度表示。若抗體量固定，所測吸光度與免疫復合物的量成正比，也與待測抗原的量成正比。以一系列已知濃度的抗原標準品作對照，即可以測出受檢物含量。南京諾爾曼生物技術有限公司H-FABP測定試劑通過參考校準品建立H-FABP含量的校準曲線，可在全自動生化分析儀上快速的測定血清中H-FABP的含量。
[0010]3免疫標記技術
[0011]免疫標記技術用于H-FABP測定的免疫標記方法有放射免疫法、酶免疫法、金標免疫法、熒光標記免疫法等。IRNA法靈敏度和特異性高，且不需要分離純化血漿，比RIA法快捷實用，但需要耗時5?36小時，不適合用于自動分析系統。國內也有部分相關產品，瑞萊生物工程(深圳)有限公司的H-FABP檢測試劑利用雙向側流免疫法，通過測定試紙檢測線和質控線上金標抗體光密度的變化可實現在2ng/mL-60ng/mL的范圍內定量檢測H-FABP濃度。
[0012]生物素-親和素系統(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫學各領域。將該系統應用于免疫組化，酶聯免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術中，可顯著地提高以上技術方法的敏感性、特異性和穩定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進行大規模流行病學調查，成為研宄免疫反應的有力工具。由于BAS檢測系統經濟快速，又無放射物質污染，不需復雜儀器，充分顯示了此系統的巨大潛力和應用的可能性。
[0013]生物素-親和素系統檢測原理:BAS是在常規ELISA原理的基礎上，結合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結合常數高達1015M-1)。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學特性的一種蛋白質，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結合一個生物素，因幾乎所有用于標記的物質均可以同親和素或鏈霉親合素結合。利用生物素-親和素系統研制心臟型脂肪酸結合蛋白檢測試快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內容】
[0014]本實用新型的目的，在于提供一種心臟型脂肪酸結合蛋白免疫層析定量檢測試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側向層析和生物素-鏈霉親和素放大系統，提供高靈敏度心臟型脂肪酸結合蛋白免疫層析定量檢測試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩定性，降低了非特異性結合，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0015]本實用新型解決其技術問題的解決方案是:心臟型脂肪酸結合蛋白免疫層析定量檢測試紙條，其包括底板，所述底板上依次設有樣品墊、熒光標記物結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標記物結合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區，所述樣品墊交疊壓在熒光標記物結合墊上，所述熒光標記物結合墊上固定有生物素標記的心臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體和鏈霉親和素標記的熒光蛋白；所述檢測區內的硝酸纖維素膜上固定有識別心臟型脂肪酸結合蛋白另外一個表位的單克隆抗體構成的檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構成的質控線。
[0016]作為上述技術方案的進一步改進，所述焚光標記物結合墊包括層疊的第一焚光標記物結合墊和第二熒光標記物結合墊，所述第一熒光標記物結合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標記物結合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0017]作為上述技術方案的進一步改進，所述第一熒光標記物結合墊中插入樣品墊下方的一端設有定位條，所述樣品墊的下端面設有能容納定位條的定位槽。
[0018]作為上述技術方案的進一步改進，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標記物結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內，所述卡殼殼面上對應于硝酸纖維膜的位置設有觀察窗，卡殼殼面上對應于樣品墊的位置設有加樣孔。
[0019]作為上述技術方案的進一步改進，所述觀察窗為長方形孔。
[0020]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0021]作為上述技術方案的進一步改進，所述樣品墊為經表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構件。
[0022]作為上述技術方案的進一步改進，所述底板為聚苯乙烯構件或者聚乙烯構件。
[0023]作為上述技術方案的進一步改進，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0024]本實用新型與現有技術相比，具有如下優點:
[0025](I)本實用新型將熒光蛋白作為標記物，此標記物穩定性良好，有利于提高檢測穩定性。
[0026](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結合，有利于提高試劑盒性能。
[0027](3)利用本實用新型進行降鈣素原的檢測時間不大于10分鐘，檢測線性范圍為0.10ng/ml?100.00ng/ml，極大地提高了檢測效率。
[0028](4)本實用新型可通過熒光免疫分析儀對結果進行判讀，可實現自動化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結果。
[0029](5)本使用新型卡殼設有樣品進入的加樣孔和供觀測結果的觀察窗，根據分析儀器判定結果，準確可靠。
[0030](6)本實用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0031](7)本實用新型檢測成本較低。
[0032](8)本實用新型可批量生產，適用于臨床