一種表面修飾的磁性納米顆粒及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及納米材料領域，尤其涉及一種表面修飾的磁性納米顆粒及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)是指自發或因診療操作脫落進入外周血循環的腫瘤細胞，通過采集外周血觀察循環腫瘤細胞在血液中的存在或含量的高低，可用于診斷腫瘤的存在、發病過程、評估患者的預后、識別患者接受治療后臨床狀況的改善情況等，同時循環腫瘤細胞的分子分析還可以反映患者腫瘤的基因信息，指導個體化用藥。
[0003]對于循環腫瘤細胞來說，目前針對其的主要分析方法是蛋白分析方法(免疫熒光染色等)和基因分析方法(例如熒光原位雜交和定量RT-PCR等)，主要是進行循環腫瘤細胞的蛋白組學和基因組學的研究。而對于循環腫瘤細胞的代謝研究，目前仍缺少耦合的平臺與技術來進行較好的分析。但是循環腫瘤細胞的代謝研究將為癌癥轉移和耐藥機制提供新的見解，提出新的循環腫瘤細胞的代謝分子研究方法將具有很大的應用潛力，也將在腫瘤研究中起到非常重要的作用。
[0004]細胞的代謝是一個動態過程，它能夠揭示細胞內在和外在的特性，并且能在生理和病理方面來研究細胞表現。此外，細胞的代謝，尤其是小分子的代謝，是其表型的多樣性以及細胞應對不同環境的直接表現。然而由于低檢測靈敏度、高樣品復雜度和復雜的樣品預處理過程使得細胞代謝的研究仍然面臨著巨大的挑戰，對于少量細胞例如循環腫瘤細胞的研究更是如此。
[0005]由于磁性微納顆粒的物理性質、表面化學和磁性，其在生物醫學方面的應用越來越普遍。在磁性分離方面，通過對顆粒材料表面化學進行調控，偶聯多種靶標進行特異性的捕獲來進行診斷和治療的研究。此外，磁性微納顆粒材料還能進行表面的功能化修飾，用其來特異性捕獲細胞和進行分子分析和檢測。同時，激光解析電離質譜技術(LDI MS)作為最基本的分子分析工具，它具有樣品處理簡單、分析速度快和能進行精準結構鑒定的特點。在LDI MS中，磁性顆粒材料不僅可以用來在樣品預處理中特異性的富集蛋白和肽段還能夠作為基質材料輔助電離過程。目前基于磁性微納顆粒的LDI MS過程主要是用來檢測諸如蛋白和肽段的生物大分子，在細胞代謝分析領域的小分子檢測仍有待進一步拓展。對于耦合循環腫瘤細胞的捕獲及其下游的代謝小分子分析則是一片空白，此類技術亟待開發。
【發明內容】
[0006]有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明提供了一種表面修飾的磁性納米顆粒及其制備方法，并提供了該磁性納米顆粒在捕獲循環腫瘤細胞以及在循環腫瘤細胞的代謝分子分析中的應用。
[0007]本發明所采用的技術方案如下:
[0008]本發明提供了一種表面修飾的磁性納米顆粒的制備方法，包括以下步驟:
[0009]步驟I:制備磁性納米顆粒；
[0010]其具體步驟還包括:
[0011 ]步驟1.1:將三氯化鐵和檸檬酸三鈉溶解在乙二醇溶液中；
[0012]步驟1.2:在步驟1.1的混合溶液中加入乙酸鈉，并超聲直到溶液變成均相體系；
[0013]步驟1.3:反應在聚四氟乙烯襯底的高壓反應釜中進行，150?195攝氏度條件下反應10小時以上，制得含鐵氧化物的磁性納米顆粒；
[0014]步驟2:使用抗體對步驟I中得到的磁性納米顆粒進行表面修飾；
[0015]步驟3:加入過量的BSA溶液封閉磁性納米顆粒表面修飾物的多余位點；
[0016]步驟4:清洗步驟3中得到的經表面修飾的磁性納米顆粒。
[0017]進一步地，上述步驟2中的抗體能夠特異性識別循環腫瘤細胞。
[0018]本發明還提供了另一種表面修飾的磁性納米顆粒的制備方法，包括以下步驟:
[0019]步驟1:制備磁性納米顆粒；
[0020]其具體步驟還包括:
[0021 ]步驟1.1:將三氯化鐵和檸檬酸三鈉溶解在乙二醇溶液中；
[0022]步驟1.2:在步驟1.1的混合溶液中加入乙酸鈉，并超聲直到溶液變成均相體系；
[0023]步驟1.3:反應在聚四氟乙烯襯底的高壓反應釜中進行，150?195攝氏度條件下反應10小時以上，制得含鐵氧化物的磁性納米顆粒；
[0024]步驟2:在步驟I中得到的磁性納米顆粒表面修飾鏈霉親和素；
[0025]步驟3:使用生物素偶聯的抗體或者適配體對步驟2中得到的磁性納米顆粒進行表面修飾；
[0026]步驟4:加入過量的BSA溶液封閉磁性納米顆粒表面修飾物的多余位點；
[0027]步驟5:清洗步驟4中得到的經表面修飾的磁性納米顆粒。
[0028]進一步地，上述步驟3中的抗體或者適配體能夠特異性識別循環腫瘤細胞。
[0029]本發明還提供了一種根據上述制備方法制備得到的表面修飾的磁性納米顆粒。
[0030]本發明還提供了上述表面修飾的磁性納米顆粒在捕獲循環腫瘤細胞中的應用，包括以下步驟:
[0031]步驟1:將表面修飾的磁性納米顆粒加入到含有循環腫瘤細胞的血液或者緩沖液中，充分混合；
[0032]步驟2:利用磁鐵分離捕獲了循環腫瘤細胞的表面修飾的磁性納米顆粒；
[0033]步驟3:清洗步驟2中捕獲了循環腫瘤細胞的表面修飾的磁性納米顆粒。
[0034]本發明還提供了上述表面修飾的磁性納米顆粒在循環腫瘤細胞的代謝分子分析中的應用，包括以下步驟:
[0035]步驟1:將表面修飾的磁性納米顆粒加入到含有循環腫瘤細胞的血液或者緩沖液中，充分混合；
[0036]步驟2:利用磁鐵分離捕獲了循環腫瘤細胞的表面修飾的磁性納米顆粒；
[0037]步驟3:清洗步驟2中捕獲了循環腫瘤細胞的表面修飾的磁性納米顆粒；
[0038]步驟4:將步驟3中得到的捕獲了循環腫瘤細胞的表面修飾的磁性納米顆粒加入到代謝分子溶液中處理0-24小時；
[0039]步驟5:將步驟4中得到的捕獲了循環腫瘤細胞的表面修飾的磁性納米顆粒在質譜靶板上制樣，并在室溫下干燥；
[0040]步驟6:利用激光解析電離質譜，對步驟5中制備的樣品進行質譜分析；
[0041 ]步驟7:對質譜結果進行分析，得出結論。
[0042]進一步地，捕獲了循環腫瘤細胞的表面修飾的磁性納米顆粒可直接用作循環腫瘤細胞代謝分子質譜分析的基質。
[0043]進一步地，可利用內標法進行代謝分子的定量檢測與分析。
[0044]進一步地，上述步驟4中的代謝分子包括糖類小分子和氨基酸小分子。
[0045]更進一步地，上述糖類小分子包括葡萄糖和蔗糖，氨基酸小分子包括苯丙氨酸和谷氨酸。
[0046]本發明通過采用磁性顆粒材料作為基質，將循環腫瘤細胞的捕獲和下游分析有機耦合，彌補了目前循環腫瘤細胞基于蛋白和基因分析方法的不足，并且克能夠對循環腫瘤細胞中的代謝分子的代謝情況進行監測。與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0047](I)磁性納米顆粒制備成本低，可以大批量制作，合成步驟簡單；
[0048](2)磁性納米顆粒能夠高效地捕獲循環腫瘤細胞，并且具有快速磁響應和紫外吸收；
[0049](3)對于微量細胞也能獲得高的捕獲效率；
[0050](4)可直接耦合下游的代謝分析；
[0051](5)磁性納米顆粒既可以作為捕獲循環腫瘤細胞的材料，又可以作為質譜分子分析的基質；
[0052](6)能夠檢測循環腫瘤細胞對于代謝小分子的代謝速度。
[0053]以下將結合附圖對本發明作進一步說明，以充分說明本發明的