一種將紫杉醇類物質固定在固相載體上的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶聯免疫檢測領域，特別是涉及一種將紫杉醇類物質固定在固相載體 上的方法。
【背景技術】
[0002] 紫杉醇（taxol)是一種四環二萜化合物，是細胞有絲分裂抑制劑，被用于癌癥治 療。紫杉醇屬有絲分裂中的微管抑制劑，紫杉醇具有聚合和穩定細胞內微管的作用，致使快 速分裂的腫瘤細胞在有絲分裂階段被牢牢固定，使微管不再分開，可阻斷細胞于細胞周期 的G2與M期，使癌細胞復制受阻斷而死亡。在癌癥治療中，患者組織中紫杉醇的含量對治 療效果很關鍵，通常需要維持較低的水平。因為對細胞而言，紫杉醇濃度過大會導致正常細 胞大量死亡。因此，經常監測患者組織中紫杉醇的含量及代謝需要一種快速、靈敏的檢測方 法。
[0003] 目前，紫杉醇的檢測方法有紫外檢測法、高效液相色譜法及競爭性抑制酶聯免 疫法（Competitive Inhibition Enzyme Immunoassay，CIEIA)等，紫外檢測法和高效 液相色譜法需要大量采集樣品，且檢測較慢、成本過高；CIEIA是利用酶聯免疫原理，通 過顯色反應，不經純化，快速檢測粗提混合物中紫杉醇的方法。Jaziri等用該方法可以 檢測到植物組織及愈傷組織中l -l〇〇ng含量的紫杉醇（Jaziri等1991. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection and the semi-quantitative determination of taxane diterpenoids related to taxol in Taxus sp. and tissue cultures. J Pharm Belg. 1991Mar_Apr ;46(2) :93_9)。利用該方法，Grothaus 等可以檢測到血衆中 0? 3ng/ml 的紫杉酉享（Grothaus 等 1993. An enzyme immunoassay for the determination of taxol and taxanes in Taxus sp.tissues and human plasma. J Immunol Methods. 1993Jan 14 ； 158(1) :5-15.) 〇
[0004] 在現有的CIEIA檢測紫杉醇的方案中，如圖1所示，紫杉醇一般通過在吡啶溶液中 與琥珀酸酐反應，生成2-紫杉醇琥珀酰單酯，然后加入牛血清白蛋白（BSA)溶液及25%二 氧六環水溶液（v/V)，使2-紫杉醇琥珀酰單酯與BSA的氨基通過酰胺鍵結合形成BSA偶聯 產物，通過BSA的吸附作用固定于微孔板1上，然后再通過CIEIA測定樣品中紫杉醇的含 量。由于將紫杉醇固定在微孔板上的該方法步驟多，效率低、時間長，不能很好地滿足經常 監測患者組織中紫杉醇的含量的需求。
【發明內容】
[0005] 為了彌補上述現有技術的不足，本發明提出一種將紫杉醇類物質固定在固相載體 上的方法。
[0006] 本發明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：
[0007] -種將紫杉醇類物質固定在固相載體上的方法，所述固相載體的表面結合有馬來 酸酐，所述方法為通過紫杉醇類物質與所述馬來酸酐反應，從而將所述紫杉醇類物質固定 在所述固相載體上。
[0008] 優選地，所述紫杉醇類物質與所述馬來酸酐反應包括如下步驟：
[0009] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇類物質和吡啶，在每毫升所述吡啶中，所 述紫杉醇類物質的含量為100-1000微克；
[0010] (2)將所述溶液加入所述固相載體，在反應溫度為25-65°C下，所述紫杉醇類物質 的2' -羥基與馬來酸酐反應至少8小時，形成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0011] 優選地，所述紫杉醇類物質與所述馬來酸酐反應包括如下步驟：
[0012] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇類物質和吡啶溶液，所述吡啶溶液包含吡 啶和能與所述吡啶互溶的溶劑，所述吡啶與溶劑的體積比大于等于1%且小于1〇〇%，在每 毫升所述吡啶溶液中，所述紫杉醇類物質的含量為100-1000微克；
[0013] (2)將所述溶液加入所述固相載體，在反應溫度為25-65°C下，所述紫杉醇類物質 的2' -羥基與馬來酸酐反應至少8小時，形成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0014] 紫杉醇在吡啶中，其較活躍的2' -OH和固相載體表面的馬來酸酐反應，而7' -OH 由于空間結構的問題較不活躍，因此反應生成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0015] 優選地，所述紫杉醇類物質的含量為200-300微克。
[0016] 優選地，步驟（2)中，反應溫度為50-60 °C。
[0017] 優選地，所述吡啶與溶劑的體積比為1-5 %。
[0018] 優選地，步驟（2)中的反應時間為30-40小時。
[0019] 優選地，步驟（1)中的所述溶劑為水、PBS緩沖液、甲醇、礦物油、甲醛、二甲基亞砜 和正己烷中的至少一種。
[0020] 優選地，所述紫杉醇類物質具有如下結構式：
[0021]
[0022]當1?1=(：6115，1?2=01 30)時，為紫杉醇；當1?1=(013)30)，1? 2=11時，為多烯紫杉醇。
[0023] -種用于檢測紫杉醇類物質的中間體，包括固相載體和紫杉醇類物質，所述固相 載體的表面結合有馬來酸酐，所述紫杉醇類物質通過與所述馬來酸酐反應從而結合在所述 固相載體上。
[0024] 本發明的優點：本發明的方法是利用經馬來酸酐活化的固相載體直接結合紫杉醇 類物質，從而可以直接進入后續的CIEIA檢測步驟，該方法反應步驟少，干擾雜質少，反應 專一性強，和現有方法相比具有在紫杉醇類物質的檢測中更加方便、快捷、靈敏、實用等優 點。
【附圖說明】
[0025] 圖1是現有技術中的紫杉醇通過BSA偶聯產物固定到微孔板表面上的反應示意 圖；
[0026] 圖2是本發明實施例1中的紫杉醇固定在孔板上的反應示意圖；
[0027] 圖3是CIEIA檢測待測樣品中紫杉醇的含量的原理示意圖；
[0028] 圖4是本發明實施例2中在450nm下測定得到的光吸收曲線；
[0029] 圖5是根據圖4中的成線性的0. 05-5ng/mL濃度區間下制得的紫杉醇標準物在 0. 05_5ng/mL區間的工作曲線。
【具體實施方式】
[0030] 下面對照附圖并結合優選的實施方式對本發明作進一步說明。
[0031] 本發明提供一種將紫杉醇類物質固定在固相載體上的方法，在一種【具體實施方式】 中，所述固相載體的表面結合有馬來酸酐，所述方法為通過紫杉醇類物質與所述馬來酸酐 反應，從而將所述紫杉醇類物質固定在所述固相載體上。
[0032] 較優地，所述方法為通過通過紫杉醇類物質的2' _羥基與所述馬來酸酐反應形成 2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0033] 在一些較優的實施方式中，所述紫杉醇類物質與所述馬來酸酐反應包括如下步 驟：
[0034] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇類物質和吡啶，在每毫升所述吡啶中，所 述紫杉醇類物質的含量為100-1000微克；
[0035] (2)將所述溶液加入所述固相載體，在反應溫度為25_65°C下，所述紫杉醇類物質 的2' -羥基與馬來酸酐反應至少8小時，形成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0036] 在另一些較優的實施方式中，所述紫杉醇類物質與所述馬來酸酐反應包括如下步 驟：
[0037] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇類物質和吡啶溶液，所述吡啶溶液包含吡 啶和能與所述吡啶互溶的溶劑，所述吡啶與溶劑的體積比大于等于1%且小于100%，在每 毫升所述吡啶溶液中，所述紫杉醇類物質的含量為100-1000微克；
[0038] (2)將所述溶液加入所述固相載體，在反應溫度為25-65°C下，所述紫杉醇類物質 的2' -羥基與馬來酸酐反應至少8小時，形成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0039] 由于過高濃度的吡啶對有機塑料基質的固相載體材料有一定的腐蝕作用，從而影 響下面的反應，因此在加入固相載體前，再加入另一可以與吡啶互溶的溶劑以減小吡啶的 濃度，通過實驗，吡啶與溶劑的體積比為1-5%時，既能使反應結果很好，又能防止吡啶對固 相載體的腐蝕。
[0040] 在以上優選實施方式中，紫杉醇類物質與馬來酸酐的反應還受到反應溫度的影 響，實驗測試了在25°C、37°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C等溫度下的反應結合效果，發現 在反應溫度為50-60°C時，效果較優。
[0041] 同樣地，反應時間也影響反應的效率，實驗測試了 8小時、16小時、24小時、32小 時、40小時和48小時的反應，發現反應反應時間為30-40小時的效率較高。實驗中也發現， 紫杉醇類物質的含量為200-300微克時較優。
[0042] 其中優選地：
[0043] 所述溶劑為水、PBS緩沖液、甲醇、礦物油、甲醛、二甲基亞砜和正己烷中的至少一 種。
[0044] 所述紫杉醇類物質具有如下結構式：
[0045]
[0046] 當札=(：6115，1?2=0130)時，為紫杉醇；當1? 1=(013)30)，1?2=11時，為多烯紫杉醇。
[0047] 固相載體可以是市售的已經用馬來酸酐表面活化的用于ELISA的微孔板，如賽默 飛（Thermo Fisher Scientific Inc.)生產的 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 96孔板；也可以是常規的微孔板，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等 材質的微孔板，然后再在微孔板的表面用馬來酸酐活化，使得馬來酸酐結合連接在微孔板 上。較優的是米用商品名為 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 的 96 孔板。
[0048] 本發明還提供一種用于檢測紫杉醇類物質的中間體，其包括固相載體和紫杉醇類 物質，所述固相載體的表面結合有馬來酸酐，所述紫杉醇類物質通過與所述馬來酸酐反應 從而固定在所述固相載體上。
[0049] 以下以紫杉醇為例，通過具體的實施例對本發明進行進一步的闡述。
[0050] 實施例1
[0051] 紫杉醇與固相載體 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 96 孔 板（以下簡稱孔板2)表面的結合，其反應示意圖如圖2所示。
[0052] 具體步驟如下：
[0053] (1)配制溶液，所述溶液中含紫杉醇物質、吡啶和溶劑，吡啶與溶劑的體積比為 2. 3%，在每毫升由吡啶和溶劑組成的液體中，紫杉醇物質的含量為233微克。
[0054] 具體為：稱取10毫克紫杉醇，溶解于1毫升吡啶中，然后取其中的105微升與4395 微升甲醛（在其他實施例中，也可以為水、PBS緩