一種用于伏馬毒素b1靈敏檢測的磁控比率熒光適配體傳感器的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及材料學、光分析化學、納米生物傳感等領域，特指一種用于伏馬毒素 B1 靈敏檢測的磁控比率熒光適配體傳感器的制備方法。
【背景技術】
[0002] 伏馬毒素(Fumonisin)是由串珠鐮刀菌、層生鐮刀菌、輪枝鐮刀菌等產生的次級代 謝產物，是一類由不同的多氫醇和丙三酸組成的結構類似的雙酯化合物。人類迄今為止已 發現了 28種伏馬毒素類似物，分為A、B、C和P族4類，其中在自然界中分布廣泛、毒性較強的 是伏馬毒素 B1 (Fumonisin B1，FB1) AB1污染的主要是玉米及其加工產品，此外還有一些如 大米、小米、高粱、牛奶、啤酒等食品。FBI可誘發人體食道癌、肝癌、胃癌的發生，并且FBI為 水溶性霉菌毒素，對熱穩定，在多數食品加工過程中均比較穩定。為此，許多國家制訂了相 應的限量標準，如歐盟規定嬰幼兒玉米制品中FBI和FB2的總含量為0.2mg kg"1，玉米中的限 量值為4mg kg-S美國H)A規定玉米中FB1、FB2和FB3總量的最高限量值為2mg kg-、玉米是 人類賴以生存的主要糧食品種之一，全世界年產近5億噸，其中我國居第二位，占總產量的 20%左右。我國所生產的玉米每年除滿足國內需求外，還大量出口到其他國家。因此，建立 完善的伏馬毒素檢測手段和監控機制，及時有效地發現和控制有關伏馬毒素的污染，及時 采取措施，從而提高中國玉米在國際市場上的質量、信譽和品牌，保證國際貿易的順利進 行。
[0003] FBI現行的檢測方法主要有薄層色譜法、近紅外光譜法、酶聯免疫吸附法、氣相色 譜法、氣相色譜-質譜聯用法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等。其中薄層色譜法 和近紅外光譜法靈敏度低且重現性較差，只能用于定性或半定量分析。而酶聯免疫吸附法 假陽性率高，且對抗體的質量要求高，不能滿足實驗室分析要求。以氣相色譜技術為基礎對 目標物進行檢測是目前公認的、準確檢測FBI的儀器分析法。該法具有靈敏度高、分離能力 強、特異性好、測定結果可靠等優點;但也存在一定的局限，如需要專業的操作人員、分析周 期長、設備昂貴且需要特殊的測試環境，而且對樣品的前處理要求嚴苛，常需要對樣品進行 衍生化，不同操作過程所使用的化學藥劑和處理途徑差別較大，易對實驗結果的精確度造 成影響，且谷物中的共提取物干擾嚴重。
[0004] 核酸適配體(Aptamer)是通過體外篩選技術，從隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中得到 的、能特異結合蛋白質或其它小分子物質的單鏈寡聚核苷酸。作為一種新型分子識別元件， 適配體一經發現便成為生物傳感領域炙手可熱的研究對象和分析工具。與抗體和酶等傳統 的分子識別元件相比，適配體作用的靶分子范圍更廣，包括毒素、免疫原性弱和不具有免疫 原性的物質；具有更高的特異性和親和性;熱穩定性好、維持活性的pH值和鹽濃度范圍廣。 此外，適配體是由人工合成的，因而不依賴于動物或細胞，制備成本低、周期短，可以在合成 時定點、隨意地連接其他功能基團和分子，具有較高的純度和加工精確性。鑒于以上諸多優 勢，近年來關于適配體的基礎及應用研究均呈現了快速發展態勢，是目前分析化學進展最 迅速的學科前沿之一。最近，相關研究人員設計了多個適配體傳感體系，分別利用電化學、 微懸臂、熒光等研究手段，實現了對FBI的分析檢測。比率熒光方法是基于兩個不同波長的 熒光強度比值來達到分析檢測目標物的方法。該方法在提高靈敏度和選擇性方面有顯著的 優勢，近年來在生物和化學檢測中引起了廣泛關注。相比于傳統的單波長熒光測量，比率熒 光傳感器可以提供內部校正以消除環境因素，激發強度變化和探針濃度等因素的干擾，大 大減少誤差，提高檢測的準確性。目前報道的比率熒光傳感器多以熒光染料或量子點為探 針，用于離子檢測和生物分析等方面。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在發明一種具有工藝簡單、成本低廉等優點的磁控比率熒光適配體傳感 器，提供一種制備高選擇性、高精確性，測量范圍寬的高靈敏檢測FBI的方法，解決現有檢測 方法成本高、檢測方案復雜、檢測時間過長、靈敏度較低、激發強度變化和探針濃度易受干 擾等難題。
[0006] 所采用的方案概括為：首先，在Si02表面靜電吸附發射綠色熒光的CdTe量子點 (gQDs)制備Si〇2@gQDs，并將其作為熒光探針與FBI的Aptamer偶聯;其次，以改進的st6ber法 合成Fe 3〇4@Si02磁性納米微球(mSi02)，在mSi02表面靜電吸附發射紅色熒光的CdTe量子點 (rQDs)制得mSi〇2@rQDs，并將其作為磁性-焚光探針與aptamer的互補DNA(cDNA)偶聯；最 后，利用Aptamer與cDNA之間的雜交反應將Si0 2@gQDs捕獲在mSi〇2@rQDs制得mSi〇2@rQDs-cDNA/aptamer-gQDs@Si〇2磁控-焚光-分子革El向納米生物復合物。該探針與目標物FBI作用 后，對其施加外源磁場分離富集未脫附的熒光信標，形成比率熒光適配體傳感體系，實現對 FBI的靈敏檢測。該比率熒光適配體傳感方法可以提供內部校正，消除環境因素、激發強度 變化和探針濃度等因素的干擾，相比于單波長熒光檢測，在提高靈敏度和精確度方面具有 非常顯著的優勢。
[0007] 本發明是通過如下具體技術方案實現的：
[0008] 一種用磁控比率熒光適配體傳感器靈敏檢測伏馬毒素 B1 (FBI)的方法，包括如下 步驟：
[0009] 步驟1、發射綠色熒光的水溶性CdTe量子點（簡稱為gQDs)水溶液和發射紅色熒光 的水溶性CdTe量子點(簡稱為rQDs)水溶液的制備；
[0010 ]步驟2、單分散S i02納米球分散液的制備；
[0011 ] 步驟3、Fe3〇4@S i 02磁珠 (mS i02)分散液的制備；
[0012] 步驟4、gQDs包覆的Si02 (簡稱為Si02@gQDs)分散液納米球的制備:取步驟2制備的 Si02納米球分散液和0.02M NaCl溶液溶解的聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)溶液于燒杯 中混合均勻，磁力攪拌反應;產物經離心分離、洗滌后，再加入步驟1中制備的gQDs水溶液， 于避光條件下磁力攪拌反應，經離心分離、洗滌后，避光自然干燥，將干燥后的產物分散到 蒸餾水中，得到Si0 2@gQDs分散液，備用；
[0013] 步驟5、rQDs包覆mSi02納米球(簡稱為mSi02@rQDs)分散液的制備:取用步驟3中制 備的mSi02分散液，向其中加入聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液，機械攪拌反應;將產物磁性 分離，二次水洗3次后，加入二次水將其重新分散，制得聚二烯丙基二甲基氯化銨修飾的 mSi〇2(簡稱為mSi〇2_PDDA);最后，加入rQDs水溶液機械攪拌，經磁性分離，二次水洗后，避光 自然干燥，將干燥后的mSi02@rQDs分散在二次水中，得到mSi02@rQDs分散液，備用；
[0014] 步驟6、Si〇2@gQDs標記的Aptamer (簡稱為Si〇2@gQDs_Aptamer)焚光探針分散液的 制備:取步驟4制備的Si02@gQDs分散液，加入1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)水溶液和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)水溶液，振蕩反應，隨后加入Aptamer儲備液，振蕩 孵育過夜，反應完畢后，離心洗滌產物，將產物重新分散在Tris-HCl溶液中，得到Si0 2@ gQDs-Aptamer分散液，備用；
[0015] 步驟 7、mSi〇2@rQDs 標記的 Aptamer 的互補鏈 cDNA (簡稱為 mSi〇2@rQDs_cDNA)磁性-熒光探針分散液的制備：取步驟5制備的mSi 02@rQDs的分散液，加入EDC水溶液和NHS水溶 液，振蕩反應，加入cDNA，振蕩孵育過夜，振蕩孵育過夜，反應完畢后，離心洗滌產物，將產物 重新分散在Tris-HCl溶液中，得到mSi0 2@rQDs-CDNA分散液，備用；
[0016] 步驟8、傳感器的構建及樣品的檢測，包括:磁控-比率熒光-靶向納米生物復合物 的制備：取步驟6制備的Si02@gQDs-Aptamer熒光探針分散液和步驟7制備的mSi0 2@rQDs-cDNA磁性-熒光探針分散液混合，進行第一次恒溫振蕩孵育，制得mSi02irQDs-cDNA/ Aptamer_gQDs@Si〇2 納米生物復合物，對產物 mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2 納米生 物復合物磁性分離、洗滌后，重新分散在Tris-HCl緩沖溶液A中，備用；
[0017] 對FBI標準品進行檢測，建立標準曲線：取所制備的mSiC^OrQDs-cDNA/Aptamer-gQDsOSiCfe 納米生物復合物與 FBI 溶液混合， 進行第二次恒溫振蕩孵育; 經磁性分離后 ，棄去 已脫附的Si〇2@gQDs，將收集得到的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2納米生物復合物 洗滌后，重新分散在Tris-HCl緩沖溶液B中，設置激發波長為365nm，掃描得到熒光譜圖，通 過熒光強度比（I g/Ir)/(Ig/Ir)()與FBI標準品濃度之間的對應關系建立標準曲線，其中，（I g/ Ir)和（Ig/Ir)o分別為存在與不存在FBI時，磁性收集的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@ Si02納米生物復合物所測得的gQDs熒光強度(Ig)和rQDs熒光強度(Ir)的比值；
[0018] 步驟9、對待測樣按照步驟8同樣的方法進行檢測，依據步驟8得到的標準曲線得