一種無囊膜病毒量子點標記方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于病毒學及水產動物醫學領域，具體涉及一種無囊膜病毒量子點標記方法，同時還涉及一種無囊膜病毒量子點標記方法的用途。
【背景技術】
[0002]作為無囊膜病毒的代表，呼腸孤病毒是呈二十面體、具有雙層衣殼、含多節段雙鏈RNA基因組的病原病毒。呼腸孤病毒的宿主范圍極廣，能感染人、脊椎動物(包括魚類)、無脊椎動物和植物，能引起宿主嚴重的病毒病，如導致魚類嚴重的出血病和高死亡率[張奇亞&桂建芳，2014，中國科學:生命科學，2014,44:1236-1252]。病毒入侵是其復制周期中至關重要的第一步。無囊膜病毒入侵宿主細胞的方式和過程與有囊膜病毒存在顯著差異[Groveet al,J.Cell B1l,2011,195(7):1071-1082；White et al,Crit Rev B1chem MolB1l，2008;43(3):189-219]。為了高效防控病毒病，須對病原入侵過程進行實時監控。利用新型材料，建立精準、穩定的單病毒顆粒示蹤技術，對了解無囊膜病毒是如何突破宿主屏障、入侵細胞的動態過程及病毒與宿主的相互作用，進而認識無囊膜病毒的致病機制，研發系列新的抗病毒藥物及相關生物制劑具有重大意義。
[0003]近些年，通過在病毒的囊膜上進行量子點(Quantum dots，DQs)標記，可對有囊膜病毒進行不蹤[Zhang et al，B1mater ial s，2013，34: 7506-7518 ; Zhang et al,Theranostics,2014,4(3): 307-315]。但是，由于無囊膜病毒缺少囊膜，尚無法按照現有方法直接對無囊膜病毒進行標記。若單獨采用熒光染料標記，則受到耐光性較弱、生物相容范圍有局限；而經基因操作用熒光蛋白標記，則可能使病毒的活性降低甚至喪失。因此，需建立既能應新型納米材料量子點高抗光漂白性、長熒光壽命和寬生物相容性等優點[Zhao etal,Chem.Commun.2008,41: 5116-5118]，同時又適合對無囊膜病毒進行量子點標記的新技術。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是在于提供了一種無囊膜病毒量子點標記方法，該技術標記病毒顆粒穩定可靠，均一性好，適用于對無囊膜病毒進行標記。
[0005]本發明的另一個目的是在于提供了一種無囊膜病毒量子點標記方法的應用。將量子點標記的無囊膜病毒接種到在玻璃底小皿上長成單層的敏感細胞中，再用綠色熒光染料指示細胞特定組分(如用細胞質膜染料CellMask?染細胞膜)，置熒光顯微鏡下持續觀察量子點標記無囊膜病毒(紅色)與細胞特定組分的相對位置，可實時追蹤病毒的運動軌跡。
[0006]這是一種針對無囊膜病毒長時間實時示蹤的高效方法。經用外衣殼蛋白免疫熒光標記無囊膜病毒測試及Image Pro Plus軟件計算，該方法標記無囊膜病毒的效率大于75%。
[0007]為了達到上述的目的，本發明采取以下技術措施:
[0008]—種無囊膜病毒量子點標記方法，包括如下步驟:
[0009]I)在無囊膜病毒懸液中，加入生物素孵育，進行無囊膜病毒的生物素化。
[0010]2)超速離心除去不完整的無囊膜病毒顆粒及其他雜質;先將生物素化的病毒懸液離心，收集沉淀，加入PBS緩沖液懸浮，經不連續蔗糖密度梯度(20 %、30 %、40 %、50 %及60% )離心，分別收集各離心條帶，加PBS洗滌后離心，收集沉淀，重懸于TE緩沖液中，負染電鏡觀察，獲得結構均一、生物素化的無囊膜病毒。
[0011]3)將步驟2)獲得的生物素化無囊膜病毒接種于易感細胞，加量子點孵育，進行無囊膜病毒量子點標記。
[0012]以上所述的方法中，優選的，所述的無囊膜病毒為大菱鲆呼腸孤病毒(SMReV)。
[0013]以上所述的方法中，優選的，離心速度為110，OOOg，離心溫度為4°C。
[0014]—種無囊膜病毒量子點標記方法的應用，包括該方法在監測無囊膜病毒侵染細胞過程中的應用，或是該方法在研究無囊膜病毒與宿主細胞互作中的應用；或是在篩選抗無囊膜病毒制劑中的應用。
[0015]具體的，利用所述的方法在監測無囊膜病毒侵染細胞過程中的應用的過程包括:量子點標記無囊膜病毒接種的細胞，用細胞質膜染料染色，熒光顯微鏡下對量子點標記無囊膜病毒的運動軌跡進行示蹤；
[0016]利用所述的方法在研究無囊膜病毒與宿主細胞互作中的應用包括:單層細胞先利用融合熒光蛋白或熒光探針等對不同細胞組分進行熒光定位，再接種的生物素化無囊膜病毒，進行量子點標記。將細胞培養不同時間后固定，對量子點標記無囊膜病毒與共定位細胞組分進行熒光顯微觀察，以查明無囊膜病毒運動方向、軌跡及與細胞互作的組分。
[0017]利用所述的方法在篩選抗無囊膜病毒制劑中的應用包括:通過在生物素化無囊膜病毒或量子點標記無囊膜病毒與其他試劑作用后，是否能與特定細胞組分結合，來篩選抗無囊膜病毒的制劑。
[0018]基于上述方法，本發明對無囊膜病毒，如呼腸孤病毒入侵魚類細胞的過程，可實時監測。通過構建不同融合基因質粒或熒光探針，還可對與無囊膜病毒作用的細胞組分(受體)進行標記和鑒定，尤其是可識別魚類呼腸孤病毒在宿主細胞中的互作組分。另外，可通過在生物素化無囊膜病毒或量子點標記無囊膜病毒與其他試劑作用后，是否能與特定細胞組分結合，來篩選研制抗魚類無囊膜病毒制劑。
[0019]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0020]1.本發明實現對無囊膜病毒單顆粒進行量子點標記，通過量子點標記，可對無囊膜病毒顆粒進行長時間實時示蹤。
[0021]2.本發明基于量子點標記、無囊膜病毒外衣殼蛋白免疫熒光標記、及細胞特定組分熒光蛋白定位相結合的策略，采用超離心分離替代脫鹽柱除去未反應試劑，顯著提高待標記無囊膜病毒的質量和數量，參照外衣殼蛋白標記，驗證了量子點標記無囊膜病毒有性能優、效率高的特點。
[0022]3.利用本發明的示蹤方法，不僅能精細準確示蹤無囊膜病毒侵入細胞膜的軌跡；且獲取無囊膜病毒在接種90min內，依次與宿主細胞早期內體、晚期內體和溶酶體共定位圖像，直觀展示無囊膜病毒SMReV是經內體一溶酶體系統進行胞質內運輸。
[0023]4.本發明提供了一種在篩選研制抗魚類無囊膜病毒制劑中的應用，是認識無囊膜病毒侵染機制和抗病毒制劑研發的有用工具。本發明還可廣泛地應用于水產動物醫學科學等領域。
[0024]5.利用本發明提供的無囊膜病毒量子點標記方法，標記效率可高達75%以上。
【附圖說明】
[0025]圖1為一種量子點標記和外衣殼蛋白免疫焚光標記的SMReV及在細胞周圍的分布。
[0026]A.單個細胞的普光顯微圖』.C和D為熒光顯微圖，其中B.量子點標記無囊膜病毒SMReV(紅色)；C.外衣殼蛋白免疫熒光標記無囊膜病毒SMReV(綠色)；D.為B和C的疊加圖，紅、綠色重疊(呈黃色)信號確定為量子點標記無囊膜病毒。標尺:5μπι。
[0027]圖2為一種無囊膜病毒SMReV的運動軌跡。
[0028]量子點標記無囊膜病毒SMReV吸附(a，示完整細胞)和穿過細胞膜進入胞質的時序變化(Os，7s，IIs和13s，細胞膜局部放大)。剛開始量子點標記無囊膜病毒SMReV與囊膜共定位(a和Os，呈黃色)，隨時間延長，量子點標記無囊膜病毒(紅色)逐漸脫離細胞膜(綠色)，進入胞質中(13s)。
[0029]圖3為一種量子點標記無囊膜病毒SMReV(紅色)與細胞內體一溶酶體系統(綠色)共定位圖像。
[0030]Rab5:在30min時，SMReV主要與早期內體共定位。Rab7:在60min時，SMReV主要與晚期內體共定位;Lysosome:在90min時，SMReV主要與溶酶體共定位。標尺:5μηι。
【具體實施方式】
[0031]本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規技術。所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業渠道。本發明實施例以對SMReV的標記方法和應用來進一步闡述，但所述的方法和應用并不限于SMReV。
[0032]實施例1:
[0033]無囊膜病毒量子點的標記方法及標記效率
[0034]I) SMRe V 擴增培養:
[0035]按常規方法，將草魚鰭條細胞系(GCF)[Ke et al.BMC Genomics 2011，12:323]進行傳代培養，16h后細胞長成單層，每25cm2培養瓶細胞接種ΙΟΟμΙ大菱鲆呼腸孤病毒(SMReV)原液，置于20°C培養，7天后收集病變細胞，反復凍融3次。4°C差異(4，000g與12，OOOg)離心20min，收集上清，獲得大菱鲆呼腸孤病毒SMReV懸液。
[0036]2)在含17個RNA拷貝的300mL的SMReV懸液中，加入濃度為0.0lmg/μΙ的生物素(sulfo-NHS-LC