基于基準點的相關顯微術的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及相關的顯微術以及特別地涉及相關的光和電子顯微術成像。
【背景技術】
[0002]生物樣本中細胞結構的顯微圖像可以揭示關于生物過程和細胞架構的重要信息。使用光學顯微術和電子顯微術兩者的相關方法產生最為綜合性的結果。例如，光顯微術信息可以用來識別樣本內的生物重要性的區域和它們的動力學(dynamics)。然后電子顯微術可以用來在固定和/或拉緊之后解析那些區域中的結構細節。
[0003]用常規光學顯微鏡收集的圖像在分辨率方面被限制到所使用的光的波長的大約一半。對于實際的光學顯微術，這個極限是200nm左右。因為這種限制，常規光學顯微鏡被說成是衍射受限的。許多技術為了提高分辨率超越衍射極限而存在。這樣的技術被稱為超分辨率技術。一個特定的技術是隨機性光學重建顯微術(STORM)。另一個技術是光激活定位顯微術(PALM)。這些技術被用于使用可以在“開”狀態和“關”狀態之間切換的熒光標記來形成樣本圖像，在所述“開”狀態中該標記發熒光，以及在所述“關”狀態中該標記不發熒光。STORM典型地使用熒光有機染料，而PALM典型地使用熒光蛋白質。當標記在熒光發射之后進入黑暗狀態并且然后在一段時間內對刺激不敏感時，實現狀態之間的切換。由于這種未激活，絕大多數標記在給定的時間處于黑暗狀態，其中僅有少數發射熒光。在形成樣本的超分辨率圖像方面，收集樣本的較大系列的單獨圖像來獨立于相鄰標記定位每個個體標記。
[0004]在單獨的圖像中，每個標記表現為衍射受限點擴散函數。將高斯擬合應用到每個點擴散函數，以及標記位置現在由高斯擬合中心處的點來表示。通過對每個標記順序成像并且應用這個過程，建立起樣本的超分辨率圖像，其允許成像越過衍射極限。可以使用例如被選擇來基于不同標記的發射光譜來將它們的發射分離的二向色性光學器件來同時地成像不同顏色的熒光染料。使用若干波長通道可以允許同時對若干不同的細胞成分成像。
[0005]PALM的一個變化形式是干涉測量PALM，或“iPALM”。通過布置多個透鏡，例如一個透鏡在樣本上方以及一個透鏡在樣本下方，所收集到的熒光可以引起與自身相干涉，以便產生干涉圖案，其取決于兩個透鏡系統之間光路長度上的差異。這允許在Z維度上的定位。
[0006]非超分辨率技術(諸如共焦成像)也允許三維熒光成像(雖然具有降低的分辨率)。本發明還可以有利于也涉及這些類型的光學成像模態的相關顯微術。
[0007]相關的顯微術涉及用使用一種成像技術所創造的一個或多個圖像覆蓋利用另一種成像技術創造的一個或多個圖像。例如，一個圖像可以通過光學顯微鏡形成以及另一個圖像可以通過帶電粒子束顯微鏡形成。在一個示例中，iPALM被用來形成光學圖像以及掃描電子束被用來形成一系列圖像，并且這些圖像被相關。iPALM技術提供了關于樣本中具體區域的定位信息，而來自于電子顯微鏡的圖像可以示出樣本的總體特性。這個過程在生物樣本成像方面是尤其有用的，其中生物樣本中的特定蛋白質或其他結構可以用有機染料來在化學上被功能化或在基因上被改性以表示熒光蛋白質，其可以用iPALM來成像。將iPALM數據與來自帶電粒子系統的數據相關提供了關于樣本的超微結構內熒光標記位置的情境信息。選擇合適的帶電粒子制備和成像技術，可以構建三維圖像來給出特定特征位于樣本中何處的極好的視角。
[0008]在上文描述的相關顯微術示例中，iPALM被用來獲得樣本的三維超分辨率熒光圖像，首先通過順序定位X-Y圖像平面中的感興趣區域以及從分子坐標(mo Iecularcoordinate)呈遞二維超分辨率圖像。從每個分子發出的光的同時多相位干涉進一步被用于提取Z軸位置，從而定義第三個維度。使用iPALM成像的相同樣本然后由帶電粒子系統來成像。帶電粒子系統可以循環操作，其中例如聚焦離子束(FIB)去除樣本的幾納米厚的層以暴露由SEM所成像的新表面。這個循環可以重復很多次以形成樣本中的逐漸更深(ever-deeper)的層的一疊圖像。
[0009]然而iPALM圖像和電子顯微術(EM)圖像的相關是受限的。用于相關的現有方法涉及使用樣本體積和支撐基板的交界面處的基準點的平面層。這允許了 X-Y平面中的精確位置信息，但在Z平面中定位不佳。例如，在二維X-Y平面中的相關通過使用如在頒發給Hess等人的美國專利N0.7,924,432( “Hess”)中所描述的技術來產生極好的數據。在這個技術中，在X和Y維度中的相關一般是直截了當地。然而，使用Hess的方法的Z平面的相關依賴于經切片的樣本的頂表面和底表面之間的插值。這變得有問題，因為樣本切片可能經歷由于電子和離子束誘發的失真而引起的變化以及由于樣本制備和插入到真空中以用于帶電粒子處理而在樣本中發生的變化。
[0010]當生物樣本被制備用于帶電粒子顯微術時，經常導致對樣本的物理變化。這些物理變化可能由于樣本的“濕”制備而發生。這樣的制備的一個示例是用重金屬著色劑給樣本著色，該重金屬著色劑在帶電粒子系統中是可見的。物理變化也可以起因于樣本在帶電粒子系統中暴露于真空環境。這些物理變化降低了使iPALM圖像與相同樣本的帶電粒子圖像相關以獲得樣本的(尤其在Z維度上的)有價值信息的能力。
[0011]已經做出了一些嘗試來克服在Z維度上精確成像的缺陷。這樣的嘗試包括在樣本的頂表面上使用熒光標記。然而，這樣的嘗試并未克服由于樣本的變形引起的數據相關中的缺陷。由使用熒光標記的當前方法所呈現出的另一個困難是熒光染料遍及包含標記的樣本體積的存在。如果染料遍及樣本體積存在，則通常對于使用需要對個別的單光子發射事件進行成像的隨機性iPALM或STORM過程來精確定位標記而言，存在過多的染料。結果，遍及樣本體積而分散的染料的亮度可能產生如此多的熒光以至于難以精確定位附近的感興趣區域。
【發明內容】
[0012]本發明包括用于光學圖像和帶電粒子圖像的三個維度中的精確相關的方法。
[0013]—些實施例提供了遍及樣本體積來分布對象或基準點的方法。這些基準點在光學圖像和帶電粒子圖像兩者中都是可見的，以及可以被用來使來自光學方法的圖像中樣本內的位置與來自帶電粒子成像的圖像中樣本內的位置相關。在一些實施例中，基準點的形狀以及基準點的位置被用來使圖像相關。
[0014]前述內容已經非常寬泛地概述了本發明的特征和技術優點以便可以更好地理解接下來的本發明的詳細描述。本發明的附加特征和優點將在下文中被描述。本領域技術人員應當領會的是，所公開的概念和具體實施例可以被容易地用作用于修改或設計用于實現本發明的相同目的的其他結構的基礎。本領域技術人員還應該認識到的是，這樣的等價構造并不脫離如在所附權利要求中所闡述的本發明的范圍。
【附圖說明】
[0015]為了更透徹地理解本發明及其優點，現在對連同附圖一起進行的以下描述做出參考，其中:
圖1示出了具有遍及樣本體積而嵌入的多個基準點的樣本。
[0016]圖2示出了根據本發明實施例的涂有染料的球形基準點。
[0017]圖3是經歷物理變形之前和之后的樣本的視圖。
[0018]圖4示出了根據本發明的安裝到基板上以用于成像的樣本。
[0019]圖5示出了用于照明和觀察熒光基準標記的光學顯微鏡的示意圖。
[0020]圖6示出了包括電子束鏡筒和離子束鏡筒的雙射束系統的示意圖。
[0021 ]圖7示出了使用雙射束系統的針對樣本的切片和觀察過程。
[0022]圖8是示出了用于制備用于相關的光和電子顯微術的樣本的步驟的流程圖。
[0023]圖9是示出了用于iPALM的步驟的流程圖。
【具體實施方式】
[0024]本文描述的方法用光學顯微術和電子顯微術之間的更精確的相關數據來產生樣本的三維圖像。該方法并未被限制于任意特定的光學顯微術技術或限制于任意特定的帶電粒子束成像技術。本發明可以與衍射受限光學技術和超分辨率光學技術一起使用。實施例也可以與寬場(broad field)光學技術(諸如PALM、iPALM、STROM、SIM、STED、結構化照明技術和4Pi)以及掃描技術(諸如掃描共焦顯微術、近場掃描光學顯微術和TIRF)這兩者一起使用。本發明可以與確定性超分辨率技術(諸如STED、GSD、RESOLFT和SSHO以及隨機性超分辨率技術(諸如SOFI和諸如SPDM、SroMphymod、PALM、FPALM、STORM和dSTORM之類的所有單分子定位方法(SMLM)) —起使用。這些技術作為示例而被列出以及并非是對本發明的應用的限制。
[0025]可以在本發明實施例中使用的帶電粒子成像技術包括掃描電子顯微術、掃描離子顯微術、透射電子顯微術和掃描透射電子顯微術，包括這些技術的變化形式，諸如透射電子顯微術層析成像技術。
[0026]本發明的一些實施例包括使用其表面上具有標記的納米球體。在一些實施例中，表面可以被功能化以及隨后被處理以提供標記，諸如熒光染料。對納米球體的這種處理優選地對表面限制了染料的存在。通過對納米球體的表面限制染料，球體的形狀可以在光學圖像中被更容易地確定，從而幫助追蹤可能對樣本體積發生的物理變化。
[0027]一旦已經使用超分辨率顯微術和帶電粒子顯微術獲得樣本體積的三維圖像，就可以比較包含在樣本體積中的基準點的位置和形狀，以及做出校正來對準位置。這允許超分辨率圖像和帶電粒子圖像中的(特別是在Z軸上的)位置之間的優良相關。
[0028]在X-Y維度上的成像以及在Z維度上的初始成像可以使用已知的系統和方