用于生成對抗細胞表面抗原的結合劑的方法和組合物的制作方法
【專利說明】用于生成對抗細胞表面抗原的結合劑的方法和組合物
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2013年9月23日提交的美國臨時申請No. 61 /881，203的優先權，該申請 的內容W引用方式全部并入本文。
【背景技術】
[0003] 結合多膚(例如抗體及其片段)作為治療劑和診斷劑在商業上是重要的。用于結合 多膚的傳統的篩選方法通常使用可溶性的抗原。然而，對于某些細胞表面抗原而言，當該抗 原由原生質膜上溶解時，在運些抗原上的構象表位改變，從而導致不能生成可W識別天然 抗原的結合多膚。因此，本領域需要用于結合多膚的新的篩選方法，其中所述的結合多膚在 它們的天然構象下可W特異性地結合細胞表面抗原。
[0004] 發明概述
[0005] 本發明提供了用于識別特異性結合細胞表面多膚的結合多膚(例如抗體或其抗原 結合片段）的方法和組合物。本發明的方法總體而言包括將結合多膚的多樣的核酸展示文 庫與細胞外部表面上展示的細胞表面抗原接觸；W及由所述的文庫分離至少一種文庫的成 員，該成員與細胞外部表面上的細胞表面抗原特異性地結合。本發明的方法和組合物是特 別有利的，原因在于它們允許快速地識別與天然形式的祀細胞表面抗原結合的結合多膚， W及具有新的表位特異性和功能性質(例如內化、激動、括抗或變構調控性質）的結合多膚。 運些方法和組合物還允許識別新的治療用途的細胞類型特異性抗原或表位。本發明還提供 了新的V-結構域(例如VH和/或化結構域)核酸展示文庫(例如DNA展示文庫），其可W用于篩 選新的結合多膚。
[0006] 附圖簡述
[0007] 圖1為示例性DNA展示組合物和篩選方法的示意圖。
[000引圖2為示例性DNA展示組合物和篩選方法的示意圖。
[0009] 圖3為在本發明的方法中使用的示例性祀細胞篩選策略的示意圖。
[0010] 圖4為在本發明的方法中使用的示例性平行選擇和深度測序策略的示意圖。
[0011] 圖5為在本發明的方法中使用的示例性平行選擇和深度測序策略的示意圖。
[0012] 圖6為在本發明的方法中使用的示例性平行選擇和深度測序策略的示意圖。
[0013] 圖7為在本發明的方法中使用的示例性平行選擇策略和深度測序分析的結果的示 意圖。
[0014] 圖8描繪了顯示使用本發明的方法選擇的高親和性VH分子的FACS基結合測試結果 的示意圖。
[0015] 圖9描繪了顯示使用本發明的方法選擇的VH分子的差異結合的圖。
[0016] 圖10描述了顯示使用本發明的方法選擇的VH分子的差異結合的圖。
[0017] 圖11為在本發明的方法中使用的示例性平行篩選和深度測序策略的示意圖，其中 具有平行功能選擇壓力的多輪活細胞選擇用于富集與特異性細胞表面蛋白質結合并調控 該蛋白質的抗體。所選的集合經bar-標記并進行深度測序。由平行選擇得到的富集序列的 比較生物信息學分析允許識別具有與前導標準(lead criteria)匹配的選擇和活性。
[0018]圖12描繪了使用本文公開的方法來識別抗-膜高血糖素受體(GCGR)VH結構域的示 例性平行篩選策略的結果。由活細胞GCGR(B類GPCR)選擇得到的富集的集合經過結合和功 能測試，包括(逆時針)競爭性結合、cAMP、無標記粘附、細胞內化和b-抑制蛋白測試。分離出 一組多樣的調控活性的抗-GCGR VH結構域，其通過多種不同的作用機制而展現出不同的功 能活性。
[0019]圖13描繪了使用本文公開的方法選擇的抗-GCGR VH結構域的cAMP和b-抑制蛋白 測試的結果。在所示的V H結構域存在或缺乏下，使用10 n M膜高血糖素挑戰表達G C G R的 肥K293細胞。克隆子B07和B05抑制GCGR誘導的b-抑制蛋白活性，但是對受體激活的cAMP的 產生具有很小的作用。
[0020] 圖14描繪了使用本文公開的方法選擇的抗-GCGR VH結構域的CAMP和葡萄糖釋放 測試的結果。在所示的GCGR VH結構域缺乏或存在下，使用化M膜高血糖素刺激原代人類肝 細胞。膜高血糖素激活的CAMP的產生和葡萄糖的釋放都受到VH結構域的抑制，表明運些克 隆子對抗內源受體和在生物相關檢測中的功能活性。
[0021] 圖15為示例性平行活細胞選擇的示意圖，其識別具有多種多樣性和功能特征的 抗-GCGR VH結構域。
[0022] 圖16描繪了使用本文公開的方法選擇的抗-CXCR4VH結構域的結合、cAMP和趨化作 用測試的結果。針對CXCR4(A類趨化因子GPCR)的活細胞功能選擇產生一組多樣的VH結構 域，其證明了與表達CXCR4的細胞的特異性結合、SDF-Ia-介導的CAMP信號傳遞的抑制、W及 在內源表達CXCR4的化rkat細胞中對配體誘導的趨化作用的抑制。
[0023] 圖17描繪了使用襲蘆堿和蝸子毒刺激的表達化Vl. 7的皿K293細胞的BIND無標記 細胞應答測試的結果。BIND允許通過檢測由光學生物傳感器的表面反射的光的峰值波長值 (PWV)的變化來進行實時無標記細胞應答測量。使用襲蘆堿(V)+蝸子毒（SVqq)刺激重組 Navl. 7/肥K293細胞W激活通道。BIND測量對通道開放的延遲的激發應答，其中所述的通道 開放會在刺激后的1小時后激發PWV的降低。河豚毒素(TTX)抑制化Vl. 7通道，并將陰性PWV 轉變為在親代HEK293細胞中觀察到的應答。
[0024] 圖18為識別與人類疾病細胞特異性結合的VH結構域的示例性平行篩選的示意圖。 使用活細胞選擇來識別在不同的細胞群體(包括基本患者與正常人類的細胞)上特異性表 達的祀物或表位。使用細胞類型特異性選擇策略并使用深度測序來識別具有預測的結合特 異性概況的富集的VH結構域。分離高親和性(PM)結合劑，其證明了疾病細胞特異性的結合 概況，可通過FACS測量。
[0025] 參考實施方案的描述
[0026] 本發明提供了用于識別結合多膚(例如抗體或其抗原結合片段)的方法和組合物， 其中所述的結合多膚與細胞表面抗原特異性地結合。本發明的方法總體而言包括將結合多 膚的多樣的核酸展示文庫與細胞外部表面上展示的細胞表面抗原接觸；W及由所述的文庫 分離至少一種文庫的成員，該成員與細胞外部表面上的細胞表面抗原特異性地結合。本發 明的方法和組合物是特別有利的，原因在于它們允許快速地識別與天然形式的祀細胞表面 抗原結合的結合多膚，W及具有新的表位特異性和功能性質（例如內化、激動、括抗或變構 調控性質）的結合多膚。運些方法和組合物還允許識別新的治療用途的細胞類型特異性抗 原或表位。本發明還提供了新的V-結構域(例如VH和/或化結構域)核酸展示文庫(例如DNA 展示文庫），其可W用于篩選新的結合多膚。
[0027] I.定義
[0028] 如本文所用，術語"核酸展示文庫"是指本領域公認的任何體外無細胞表現型-基 因型的相關展示，包括但不限于在例如美國專利No . 7，195，880; 6，951，725; 7，078，197; 7， 022,479；6,518,018；7,125,669；6,846,655；6,281,344；6,207,446；6,214,553；6,258, 558；6,261,804；6,429,300；6,489,116；6,436,665；6,537,749；6,602,685；6,623,926；6, 416,950;6,660,473;6,312,927;5,922,545;6，：348,315，胖02012125733和胖02010/011944中 列出的那些，運些文獻的全部內容均W引用方式并入本文。
[0029] 如本文所用，術語"抗原"是指結合多膚所識別的分子。
[0030] 如本文所用，術語"特異性結合"是指結合分子(例如VH或化結構域）W至少大約Ix 1〇-6m，1x 1〇-7m，1x 1〇-8m，1x 1〇-9m，1x l〇-i〇M，lx 1〇-iiM，1x 1〇-i2m,或更高的親和性與抗原 結合、和/或W針對非特異性抗原的親和性至少2倍W上的親和性與祀物結合的能力。
[0031] 如本文所用，術語"抗體"是指免疫球蛋白分子或其多聚體(例如IgM),其中所述的 免疫球蛋白分子包含4條多膚鏈，其中2條重鏈化)和2條輕鏈化)通過二硫鍵相互連接。每條 重鏈包含重鏈可變區（簡稱為VH)和重鏈恒定區。重鏈恒定區包含3個結構域CHl、CH2和CH3。 每條輕鏈包含輕鏈可變區（簡稱為化)和輕鏈恒定區。輕鏈恒定區包含1個結構域(CL1) "VH 和化區可W進一步細分成超變區，稱為互補性決定區（CDR)，其散布于更保守的稱為構架區 (FR)的區域中。
[0032] 如本文所用，術語抗體的"抗原結合部分"包括特異性地結合抗原從而形成復合物 的任何天然形成的，可酶法獲得的、合成的或基因改造的多膚或糖蛋白。可W使用任何合適 的標準的技術，例如由完整的抗體分子來衍生抗體的抗原結合片段，其中所述的技術例如 有蛋白水解消化或設及編碼抗體可變區和可任選的恒定區的DNA的操縱和表達的重組基因 改造技術。抗原結合部分的非限定性實例包括：（i)化b片段；（ii)F(ab'）2片段；（iii)Fd片 段；（iv)Fv片段；（V)單鏈Fv(ScFv)分子；（vi)dAb片段；W及(Vii)最小識別單元，其由模擬 抗體的超變區的氨基酸殘基組成(例如分離的互補性決定區(CDR))。其他改造分子(例如雙 特異性抗、=特異性抗、四特異性抗和微抗體)也涵蓋在表達"抗原結合部分"范圍內。
[0033] 如本文所用，術語"V結構域"是指包含VH結構域或化結構域的單一多膚，其缺乏促 進所述的VH結構域或化結構域分別與互補化結構域或VH結構域共價配對的恒定區序列。
[0034] 如本文所用，術語"VH結構域"和"Wi吉構域"分別指單一抗體的重鏈可變結構域和 輕鏈可變結構域，其包含FR(構架區）1、2、3和4，W及CDR(互補性決定區）1、2和3(參見see Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest.(NIH 化blication No.91-3242,Bethesda)。
[0035] 如本文所用，術語"FR1-FR3"是指包含FRl，CDR1，FR2，CDR2和FR3但排除CDR3和FR4 區的VH區。
[0036] 如本文所用，術語乂DR3-FR4"是指包含CDR3和FR4但排除FRl，CDRl，FR2，CDR2和 FR3區的VH區。
[0037] 關于抗體的可變區，如本文所述，術語"嵌合的"是指包含由2個或多個不同的抗體 可變結構域得到的氨基酸序列的抗體可變結構域，例如具有由參照抗體得到的CDR3序列和 由一個或多個不同的抗體得到的FR1-FR3序列的可變結構域。
[00：3引 II.細胞表面抗原
[0039] 在某些方面中，本發明提供了識別特異性地結合細胞表面抗原的結合多膚的方 法。
[0040] 能夠在細胞表面上展示的任何抗原可W用于本發明的方法中，包括但不限于蛋白 質、多糖和/或脂質抗原。在某些實施方案中，抗原為天然形成的分子。適當地，天然形成的 抗原的非限定性實例包括跨膜蛋白質（例如G-蛋白偶聯受體)和GPI錯定蛋白質。在某些實 施方案中，抗原為非天然形成的重組或合成的抗原。適當地，天然形成的抗原的非限定性實 例包括但不包括包含由不同的抗原分子得到的部分的嵌合抗原。在某些實施方案中，在實 施本發明的方法之前，抗原的特性是已知的。在某些實施方案中，在實施本發明的方法之 前，抗原的特性是未知的。
[0041] 在某些實施方案中，抗原為跨膜蛋白質。在某些實施方案中，抗原為多次跨