一種古代羊毛的特異性免疫檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及文物檢測技術領域，尤其涉及一種古代羊毛的特異性免疫檢測方法。
【背景技術】
[0002]羊毛是天然蛋白質纖維，是由氨基酸通過肽鍵作用連接而成的天然高分子材料。羊毛織物埋藏在地底下，經過溫度、濕度、土壤的酸堿性、細菌、霉菌等的影響，蛋白質纖維容易被老化、降解。羊毛織物在老化的過程中，多肽鏈發生斷裂，結晶度降低，導致絲織品物理特性(諸如拉伸強度、延伸率、柔韌性、吸濕能力等)和化學特性(特征粘度、分子量等)的變化。尤其是墓葬中出土的衣物，由于受到體液、尸腐物的侵蝕，從而變硬、變脆，甚至礦化、降解，在肉眼下已經無法辨識，且年代越早的證據越難尋覓，給羊毛類文物的鑒定和保護研究帶來了很大的困難。因此如何利用現代先進的自然科學手段，從羊毛微痕跡中提取古代羊毛的信息，具有重要的科學和文化價值。
[0003]現階段，國內外對古代羊毛織物的研究較少，國內外對于羊毛微痕跡的鑒定，大多數還停留在對纖維形態的分析上，所得出的鑒定結果也沒有十足的準確性。如何尋找一種更為科學的手段來鑒定羊毛微痕跡一直是文物保護界懸而未決的難題。
【發明內容】
[0004]為了解決上述技術問題，本發明提供了一種古代羊毛的特異性免疫檢測方法。利用本發明方法制備的檢測試紙對古代羊毛微痕跡進行檢測時，具有快速、準確、高靈敏性的特點。
[0005]本發明的具體技術方案為:一種古代羊毛的特異性免疫檢測方法，采用以下步驟:a.熒光標記特異性羊毛抗體的制備:采用1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺介導法偶聯銪標記聚苯乙烯納米球和特異性羊毛抗體，制得熒光標記特異性羊毛抗體。
[0006]b.試紙的組裝:將上述制備的熒光標記特異性羊毛抗體噴涂在玻璃纖維素膜上，然后置于36-38Γ下干燥;將羊毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗體分別劃在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上，并置于36-38Γ下干燥;分別將樣品墊、熒光標記結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊組裝在PVC底板上，將組裝好的板條切成條狀，制得檢測試紙，備用。
[0007]c.試紙的靈敏性檢測:配制梯度濃度的羊毛角蛋白抗原溶液，分別取等量滴加到樣品墊上，進行熒光檢測，得到試紙的檢測線熒光強度和羊毛角蛋白抗原溶液濃度之間的標準曲線和回歸方程;分別測定15-25組空白樣品的熒光強度，其平均值作為陽性樣品熒光強度的最高閾值;根據回歸方程計算該閾值對應的最低羊毛角蛋白抗原檢測濃度，即檢測下限，作為試紙靈敏性的標準。
[0008]d.古代羊毛的特異性免疫檢測:取古代羊毛微痕跡樣品，研磨均勻，溶于PH7.4的PBS緩沖液中使古代羊毛微痕跡樣品濃度為lmg/mL，攪拌均勻，0.5-1.5h后取一滴上清液滴在檢測試紙的樣品墊上;20-30min后，進行熒光檢測，得到檢測線熒光強度與步驟c中的陽性樣品熒光強度的最高閾值進行比較，如果熒光強度低于閾值，說明樣品中含有羊毛角蛋白，該微痕跡樣品為羊毛微痕跡;如果熒光強度高于閾值，說明樣品中不含羊毛角蛋白，該微痕跡樣品不是羊毛微痕跡。
[0009]作為優選，所述熒光標記特異性羊毛抗體的制備方法具體為:分別將銪標記聚苯乙烯納米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和特異性羊毛抗體加入到20 mmol/L的PBS緩沖液中；在室溫條件下攪拌反應1.5-2.5h后，將得到的產物用10 mmol/L的PBS緩沖液洗滌，然后重新分散于含有0.l%(w/v)牛血清蛋白的40 mmol/L的Tris-HCl溶液中封閉未反應的羧酸鹽;最后采用離心法收集得到熒光標記羊毛檢測抗體，將抗體于4 °C下保存備用。
[0010]作為優選，所述銪標記聚苯乙烯納米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和羊毛檢測抗體的質量比為1:30:30。
[0011]作為優選，在步驟b中熒光標記羊毛檢測抗體的噴涂量為IyL/cm。
[0012]作為優選，在步驟b中羊毛角蛋白抗原的濃度為4.8mg/mL；山羊抗兔抗體的濃度為1.5mg/mL;羊毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗體的用量為I yL/cm。
[0013]作為優選，所述檢測試紙的具體組裝方法為:在PVC底板長1.5cm端下側粘貼樣品墊，在PVC底板下方距離Icm處粘貼熒光標記結合墊，所述熒光標記結合墊與樣品墊重合1mm，在PVC底板中間2.5 cm處粘貼上述硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜和熒光標記結合墊重合I mm，在PVC底板上方2cm處粘貼吸水墊，硝酸纖維素膜和所述吸水墊重合I mm;將組裝好的板條切成條狀，制得檢測試紙，裝于塑料卡中備用。
[0014]作為優選，步驟b中切成條狀后的檢測試紙的寬度為4mm。
[0015]作為優選，步驟c中所述空白樣品為不含羊毛角蛋白抗原的PBS緩沖液。
[00?6]作為優選，步驟c中羊毛角蛋白抗原溶液的梯度濃度分別為Ong/mL、1ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、10ng/mL。
[0017]與現有技術對比，本發明的有益效果是:
(I)利用免疫層析的原理和方法，結合考古學信息，構建基于免疫層析技術的羊毛文物微痕檢測體系，可為早期墓葬和遺址中已經化作無形的羊毛殘留物提供一種敏感、特異、快捷的辨識方法。
[0018](2)開發針對羊毛微痕檢測的免疫熒光層析試紙，為古代羊毛現場檢測提供產品和技術支撐。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
[0020]實施例1
一種古代羊毛的特異性免疫檢測方法，采用以下步驟:
a.焚光標記特異性羊毛抗體的制備:分別加入Iyg銪標記聚苯乙稀納米球、10 uL 3mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和30 uL lmg/mL特異性羊毛抗體到10 mL的20 mmo I /L的PBS (pH 7.4)緩沖液中；在室溫條件下攪拌反應2小時后，得到的產物用10mmol/L的PBS緩沖液洗滌，重新分散于含有0.l%(w/v)牛血清蛋白的40mmol/L的Tris-HCl溶液中封閉未反應的羧酸鹽。采用離心法收集熒光標記特異性羊毛抗體，于4°C冰箱中保存備用。
[0021]b.試紙的組裝:將熒光標記特異性羊毛抗體噴涂在玻璃纖維素膜上(噴涂量為I μ17011)，然后將其置于37°(:下干燥。將羊毛角蛋白抗原(4.8 mg/ml)和山羊抗兔抗體(二抗，
1.5mg/ml)分別劃在硝酸纖維素膜的檢測線(T)和質控線(C)上(劃膜儀，用量為lyL/cm)，并置于37°C下干燥。在PVC底板長1.5 cm端下測粘貼樣品墊，在PVC底板下方距離1.0 cm的地方粘貼焚光標記結合墊(焚光標記結合墊與樣品墊重合I mm)在PVC底板中間2.5 cm處粘貼硝酸纖維素膜(上面噴涂有T線和C線，硝酸纖維素膜和熒光標記結合墊重合I _)。在PVC底板上方2 cm處粘貼吸水墊(硝酸纖維素膜和吸水墊重合I mm)。將組裝好的板條切成寬4_的小條狀，裝在塑料卡里面備用。
[0022]c.試紙的靈敏性檢測:配制Ong/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的羊毛角蛋白抗原溶液，分別取20 yL滴加到樣品墊上;25 min后，將試紙置于免疫熒光定量檢測儀中進行檢測，得到檢測線熒光強度和羊毛角蛋白抗原溶液濃度之間的標準曲線和回歸方程;分別測定20組空白樣品(不含羊毛角蛋白抗原的PBS緩沖液)的熒光強度，其平均值18500作為陽性樣品熒光強度的最高閾值;根據回歸方程計算該閾值對應的最低羊毛角蛋白抗原檢測濃度40ng/mL，即檢測下限，作為試紙靈敏性的標準。
[0023]d.古代羊毛的特異性免疫檢測:取2mg古代羊毛微痕跡樣品，研磨均勻，溶解于2mL PBS (pH 7.4)緩沖溶中，攪拌均勻，Ih后取一滴上清液滴在組裝好的試紙條的樣品墊上;25 min后，將試紙置于免疫熒光定量檢測儀中進行檢測，得到檢測線熒光強度與步驟c中的陽性樣品熒光強度的最高閾值18500進行比較，如果熒光強度低于18500，說明樣品中含有羊毛角蛋白，該微痕跡樣品為羊毛微痕跡;如果熒光強度高于18500，說明樣品中不含羊毛角蛋白，該微痕跡樣品不是羊毛微痕跡。
[0024]實施例2
一種古代羊毛的特異性免疫檢測方法，采用以下步驟:
a.焚光標記特異性羊毛抗體的制備:分別加入Iyg銪標記聚苯乙稀納米球、10 uL 3mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和30 uL lmg/mL特異性羊毛抗體到10 mL的20 mmo I /L的I3BS (pH 7.4 )緩沖液中；在室溫條件下攪拌反應1.5小時后，得到的產物用10mmol/L的PBS緩沖液洗滌，重新分散于含有0.l%(w/v)牛血清蛋白的40mmol/L的Tris-HCl溶液中封閉未反應的羧酸鹽。采用離心法收集熒光標記特異性羊毛抗體，于4°C冰箱中保存備用。
[0025]b.試紙的組裝:將熒光標記特異性羊毛抗體噴涂在玻璃纖維素膜上(噴涂量為1μL/cm)，然后將其置于360C下干燥。將羊毛角蛋白抗原(4.8 mg/ml)和山羊抗兔抗體(二抗，
1.5mg/ml)分別劃在硝酸纖維素膜的檢測線(T)和質控線(C)上(劃膜儀，用量為lyL/cm)，并置于36°C下干燥。在PVC底板長1.5