一種腎癌患者外周血Vimentin檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測Vimentin的新方法，尤其是通過外周血檢測腎癌患者 Vimentin的方法。
【背景技術】
[0002] 波形蛋白（Vimentin)是一種重要的中間絲纖維蛋白，主要生物學功能為:維持細 胞與細胞器形態、促進細胞粘附及移行、參與有絲分裂及細胞分化、創傷愈合、信號傳導、移 植免疫及細胞凋亡等。其主要在間葉組織中表達，可作為在組織病理學診斷中鑒別腫瘤細 胞分化起源的特異性生物標記物。研究表明，Vimentin高表達與腎癌細胞的分化程度低、侵 襲性強和易轉移有密切關系，Vimentin可作為腎癌分期、分級及預后判斷的指標，為腎癌術 后靶向藥物或細胞因子輔助治療提供依據及治療靶點，因此，正確檢測腎癌患者的 Vimentin表達至關重要。
[0003]目前通常使用的Vimentin檢測方法有兩種。一種是免疫組織化學方法，通過檢測 腎癌組織標本中的Vimentin蛋白表達情況判定Vimentin狀態。另外一種方法是蛋白免疫印 跡法(Western blot)，特異性更高，目前臨床應用亦越來越多。這兩種檢測方法均是以腎癌 組織為檢測對象，尤其適用于腎癌行手術切除治療的患者。但對于部分缺乏手術指征或存 在手術禁忌癥的腎癌患者（如晚期腎癌患者），由于腫瘤組織無法切除，細針穿刺組織又容 易造成腫瘤播散，Vimentin狀態評估變得困難。
【發明內容】
[0004] 循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)是從實體腫瘤脫落而進入外周血 液循環的腫瘤細胞，它存在于腎癌、乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中，其檢測 對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨 床意義。因 CTC檢測具有微創、實時等特點，被稱為"液態活檢"。
[0005] 為了克服晚期腎癌患者不適宜組織標本取材，進而無法評估患者Vimentin狀態的 不足，本發明提供了一種腎癌患者外周血Vimentin檢測方法:利用膜過濾裝置分離獲得無 法獲取組織標本的晚期或復發腎癌患者外周血中的CTC，運用細胞蠟塊技術制作薄層切片， 進而檢測Vimentin表達情況。
[0006] 本發明采用的技術方案如下：
[0007] -、利用膜過濾裝置分離獲得無法獲取組織標本的晚期或復發腎癌患者外周血中 的 CTC:
[0008] 1、采集晚期腎癌患者外周血:肘正中靜脈5ml;
[0009] 2、外周血樣預處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：lmmol/1 EDTA+ 0.1%BSA，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%;
[0010] 3、利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環腫瘤細胞： 將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過 濾；
[0011] 4、過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環腫瘤細胞染色液 加入到濾器中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，用精細鑷子取下濾膜，放置在載玻片上，干 燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC。
[0012] 二、運用細胞蠟塊技術制作薄層切片：
[0013] 1、脫色：將上述載玻片上帶有CTC的濾膜取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去 CTC染色液，所述脫色液為:95 %酒精與100 %二甲苯按體積比1:1混勻。
[0014] 2、包裹:浸泡結束后取出濾膜，用吸水紙包裹；
[0015] 3、固定:將包裹物置于10%中性福爾馬林中，固定4_6h;
[0016] 4、浸蠟包埋：固定結束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細 胞石蠟塊；
[0017] 5、薄層切片:用切片機將細胞石蠟塊連續切片，制成厚度為4μπι的薄層切片。
[0018] 三、檢測Vimentin表達情況：
[0019] 1、薄層切片在染色缸中按以下步驟進行脫蠟和水化:二甲苯溶液浸泡3次，每次10 分鐘;無水乙醇溶液浸泡3次，每次5分鐘;95 %乙醇溶液浸泡5分鐘;85 %乙醇溶液浸泡5分 鐘;75%乙醇溶液浸泡5分鐘;蒸餾水浸泡2次，每次3分鐘;PBS(PH = 7.4)浸泡3次，每次3分 鐘；
[0020] 2、采用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復法對組織抗原進行修復:取pH = 6.0檸檬 酸鹽緩沖液800_1500ml于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐 高溫不銹鋼切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，鍋蓋繼續加熱至噴汽開始計時，1-2分鐘后， 壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用pH = 7.2-7.4的roS 沖洗兩次，每次各3分鐘；
[0021] 3、3%H2〇2去離子水孵育5分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次2分 鐘；
[0022] 4、滴加Vimentin-抗，室溫或37°C孵育1-2小時或4°C過夜，PBS沖洗3次，每次2分 鐘；
[0023] 5、滴加通用型IgG抗體，室溫或37 °C孵育15分鐘，PBS沖洗3次，每次2分鐘；
[0024] 6、應用DAB溶液顯色：甩去roS液，每張切片加2滴或100μΙ新鮮配制的DAB溶液，顯 微鏡下觀察3-10分鐘；
[0025] 7、蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明封片:蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘;蘇木素復染1分 鐘;0.1 %鹽酸酒精分化;0.1 %氨水返藍；50 %、70 %、85 %、95 %、無水乙醇脫水干燥;二甲 苯透明，中性樹脂膠封片；
[0026] 8、細胞病理學專家閱片，根據細胞著色程度判定Vimentin表達情況。
[0027] 步驟中所述的膜過濾分離腫瘤細胞裝置，包括濾器、血樣容器、廢液缸和鐵架臺， 所述鐵架臺設有底座、立架和支架，所述血樣容器通過支架設置于鐵架臺上部，血樣容器的 下方為濾器，濾器通過輸液器聯通至廢液缸，廢液缸設置于底座上。
[0028] 所述濾器包括濾器上口、濾膜、載濾膜平臺和濾器下口，濾膜置于載濾膜平臺上； 濾器上口接血樣容器，濾器下口通過輸液器接廢液缸。
[0029] 所述濾膜為疏水材料制成，其上均勻布滿口徑為10微米的濾孔。
[0030]本發明的有益效果是:通過該技術方法，不用取材腎癌組織即可檢測到腎癌患者 vimentin表達情況。該技術屬于微創甚至無創，并能夠實時檢測。
【附圖說明】
[0031 ]圖1為本發明的膜過濾裝置結構示意圖；
[0032] 圖2為本發明膜過濾裝置的濾器的結構示意剖視圖；
[0033] 圖3為本發明膜過濾裝置的濾器濾膜的結構示意圖；
[0034] 圖4為晚期腎癌患者外周血分離獲取的循環腫瘤細胞影像圖；
[0035]圖5為晚期腎癌患者外周血循環腫瘤細胞Vimentin免疫組化染色圖像。
[0036] 圖中：1鐵架臺、2血樣容器、3濾器、4輸液器、5廢液缸、6濾器上口、7濾膜、8載濾膜 平臺、9濾器下口、10濾孔、11底座、12立架、13支架。
【具體實施方式】
[0037] 下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0038] 運用此技術方法分離獲取并鑒定8例晚期腎癌患者（同時檢測8例正常人樣本做陰 性對照)外周血循環腫瘤細胞的實施例。
[0039] -、利用膜過濾裝置分離獲得無法獲取組織標本的晚期或復發腎癌患者外周血中 的 CTC:
[0040] 采集各樣本外周血5ml，用45ml稀釋液(成分：lmmol/l EDTA+0.1%BSA)稀釋外周 血，然后加入3ml的4%多聚甲醛固定稀釋后的血樣10分鐘。
[0041] 在固定的間期，組裝膜過濾裝置:如附圖1、圖2、圖3所示，該過濾裝置由濾器3、濾 膜7、血樣容器2、廢液缸5、鐵架臺1構成。
[0042]用lOmlPBS潤濕濾器3,然后將固定好的外周血樣加入到膜過濾裝置的血樣容器2 中，使其依靠重力自然過濾，CTC被截留在濾膜7上。
[0043] 腫瘤細胞直徑一般大于15微米，而血細胞(包括紅細胞、白細胞)直徑一般小于10 微米，因此當含有CTC的外周血經過濾后，血細胞因直徑小于濾孔能夠被濾過，而CTC因直徑 大于濾孔被截留在濾膜上。
[0044]過濾結束后，從過濾裝置中取下濾器3，打開并移走濾器上口 6，將循環腫瘤細胞 Diff染色液加入到濾器3中，染色2min。
[0045] PBS緩沖液將濾器3沖洗干凈，用精細鑷子取下濾膜7，細胞面朝上，放置在載玻片 上。
[0046] 將濾膜7適當干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC。
[0047] 檢測結果:8例健康志愿者均未查到循環腫瘤細胞;4例晚期腎癌患者檢測到循環 腫瘤細胞(表1)