一種基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗的gcrv病毒ⅱ型抗體檢測試劑盒及其方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗的草 魚呼腸孤病毒π型抗體檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤 病毒科一新成員，是中國大陸分離的第一株魚類病毒。該病毒主要引起中國、越南、緬甸等 亞洲國家淡水養殖中的草魚品種在魚種階段發生出血病，死亡率一般為30%-50%，最高可 達60%-90%，而且還能感染青魚、麥穗魚、布氏餐條魚等，并能使這幾種魚發生出血病癥狀 而死亡，該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發病季節長，嚴重影響了廣大養殖者的積極性和 我國淡水養殖業的健康發展。草魚呼腸孤病毒具雙層衣殼，病毒粒子平均直徑為60 nm-70nm，二十面體對稱，無囊膜，基因組由11條分節段的雙鏈RNA組成。目前己經報道了20多個 分離株，包括6〇^854、6〇^861、6〇^873、6〇^875、6〇^876、6〇^991、!1962、2￥-8802、6〇^-854、GCRV HZ08、JX09-01、GCRV-104、GD10、HuNanl307、GZ1208等，不同分離株在基因組序 列、基因組帶型、細胞病變、對草魚的致病力等方面差異較大。草魚呼腸孤病毒至今還沒在 血清學或者基因型上對其進行系統分類。根據現有的分離株序列信息，進行核苷酸序列與 氨基酸序列比對以及構建系統進化樹分析，所有毒株總體上可以分為3大類，分為3個基因 型，8卩60^1型（代表株為60^-873與60^-冗09-()1)、60^11型（代表株為60^-!1208與 GCRV-GD10)和GCRV ΙΠ 型(GCRV-104，GCRV-HB1007)。當前，全國各地分離到的流行株中，三 類亞型均有報道，有的單獨感染，也有混合感染。通過我們2011年至2015年這5年的草魚出 血病監測和流行病學調查分析表明，目前導致草魚出血病流行和爆發的最主要為GCRV Π 型。因此，對GCRV Π 型病毒引起的草魚出血病的特異性診斷具有重要意義。
[0003] 草魚呼腸孤病毒的檢測方法有多種，各具優勢和缺陷，病毒分離、電鏡觀察、核酸 帶型分析至今仍是檢測草魚呼腸孤病毒普遍采用的方法，但這些方法法費時費力、操作比 較復雜，不能對病毒進行快速診斷，不利于草魚出血病的流行病學調查工作。全病毒診斷涉 及病毒培養、純化及濃縮等過程，不僅制作過程復雜，耗時，成本較高，而且還潛在散毒危 險，因此不利于推廣使用。當前，對于草魚呼腸孤病毒的檢測，最為常用的方法是基于PCR擴 增技術的各種分子生物學檢測方法，包括常規的RT-PCR和熒光定量PCR等，具有較高的敏感 性和特異性。但這些分子生物學方法都是檢測病毒的核酸存在與否，方法單一，經常導致假 陽性和假陰性結果，難于對該病做到確診。因此，急需其它方法來彌補分子生物學檢測方法 的不足，如各種免疫學(血清學)檢測方法。
[0004] 目前，針對草魚出血病的疫苗，無論是法規許可的細胞弱毒疫苗還是市場上流行 的土法疫苗，甚至一些細胞滅活疫，絕大部分都是針對GCRV Π 型的疫苗。而對這些疫苗免 疫效果的評價，只是根據免疫草魚的死亡率來初步估計，一旦其它疫病的爆發導致免疫草 魚死亡，就無法弄清是由于疫苗效果不好，草魚出血病依然爆發導致而的死亡，還是由于其 它疫病的爆發而導致的死亡，更無法對疫苗免疫效果進行評價。因此，也急需要一種檢測 GCRV特異性抗體的免疫學檢測方法。臨床和實驗室試驗證實草魚出血病弱毒疫苗是預防控 制草魚出血病的有效生物制劑，而對草魚呼腸孤病毒特異性抗體的監測是評價魚出血病疫 苗免疫效果及合理制定免疫程序的關鍵。對于草魚呼腸孤病毒抗體的檢測，目前還沒有有 效可靠的方法，ELISA方法特異性好、靈敏度高、快速易行，可進行大量樣品的檢測，但存在 病毒抗原或重組蛋白抗原純化條件苛刻、試劑保存條件要求高、檢測需要酶標測定儀，只能 在具有一定條件的實驗室使用等缺點。
[0005]
【發明內容】
[0006] 為了解決上述存在的問題，本發明建立的GCRV Π 免疫過氧化物酶單層細胞試驗 (immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)采用病毒感染細胞后固定作為檢測抗原，試 驗過程所需時間短、特異性好、敏感性高、操作方便、性能穩定、易于臨床推廣，并且觀察時 只需普通的光學顯微鏡，適用于基層流行病學調查、臨床檢測和疫苗免疫后血清抗體的監 測 。
[0007] 本發明的目的是提供一種基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗的草魚呼腸孤病毒 Π 型抗體檢測試劑盒。
[0008] 本發明所采取的技術方案是： 一種基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗的草魚呼腸孤病毒π型抗體檢測試劑盒，該試 劑盒含有細胞內陽性抗原。
[0009] 進一步的，所述細胞內陽性抗原固定在細胞培養板上。
[0010] 進一步的，所述細胞內陽性抗原為感染了 Π 型草魚呼腸孤病毒的細胞。
[0011] 進一步的，所述細胞為草魚鰾細胞系GSB。
[0012] 進一步的，所述細胞內陽性抗原固定在細胞培養板上的具體操作為:將草魚呼腸 孤病毒HZ08株接種到新消化的GSB細胞懸液中，混勻，加入到細胞板中，于27.5°028.5°C條 件下培養至形成單層細胞后取出，棄去細胞培養液，用PBS清洗后，用固定液固定12~17 min，干燥后即可。
[0013]進一步的，該試劑盒還含有抗草魚IgM單克隆抗體，HRP標記的羊抗鼠單克隆抗體 IgG〇
[0014] 進一步的，該試劑盒還含有細胞內陰性抗原，陽性對照血清，陰性對照血清，樣品 稀釋液，磷酸鹽緩沖液洗滌液，AEC顯色液和血清稀釋板。
[0015] 進一步的，所述細胞內陰性抗原為未感染草魚呼腸孤病毒的細胞，固定在細胞板 中； 所述陽性對照血清為經草魚呼腸孤病毒疫苗株892株病毒免疫后的血清，ELISA抗體效 價在1:400以上； 所述陰性對照血清為未經草魚呼腸孤病毒免疫的血清； 所述樣品稀釋液由25mM DTT、100mM pH8.0的Tris緩沖液、2mM pH8.0的EDTA和200mM NaCl組成。
[0016] 進一步的，所述細胞為草魚腦細胞系GSB。
[0017] -種基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗的草魚呼腸孤病毒Π 型抗體檢測方法，包 括如下步驟： 1) 將固定有細胞內陽性抗原和細胞內陰性抗原的細胞板，于室溫預熱25~35 min，PBS 洗1~2次； 2) 加入一抗:用PBS將待檢血清進行系列稀釋后，分別加入固定有細胞內陽性抗原或細 胞內陰性抗原的細胞板孔中，每孔80~130μΜ另外加入陽性對照血清、陰性對照血清分別 作為陽性對照和陰性對照； 3) 溫育和洗滌:36.5~37.5 °C濕盒孵育45~75min，PBS洗滌； 4) 加入二抗:加入稀釋如的抗草魚IgM單克隆抗體，每孔80~130yL; 5) 溫育和洗滌：同步驟3); 6) 顯色：加入底物ACE，每孔80~12〇uL，室溫顯色15~45 min; 7) 去除底物液，每孔加入roS，用光學顯微鏡觀察，判定結果。
[0018] 本發明的有益效果是： 1、 本發明的基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗的草魚呼腸孤病毒Π 型抗體檢測試劑 盒可以對無明顯CPE(細胞病變）的Π 型草魚呼腸孤病毒進行定量分析，測定病毒的濃度和 滴度； 2、 本發明的基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗的草魚呼腸孤病毒Π 型抗體檢測試劑 盒可以對草魚呼腸孤病毒Π 型特異性抗體的進行定性檢測，同時可以檢測草魚多份血清樣 品并達到早期診斷的目的，對草魚出血病的診斷、流行病學調查和病原監測具有較高的臨 床使用及推廣價值； 3、 本發明的基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗的草魚呼腸孤病毒Π 型抗體檢測試劑 盒能用于疫苗免疫注射后抗體的檢測，進行疫苗免疫效果的評價，為草魚出血病的預防控 制和免疫監測等提供科學的技術手段。通過該試劑盒的應用，將為我國控制并最終消滅草 魚出血病提