一種基于螺環材料的膽固醇生物傳感器的制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及生物傳感器的制備，尤其涉及一種基于螺環材料的膽固醇酶生物傳感 器的制備。
【背景技術】
[0002] 膽固醇是一種可廣泛存在于生物體的脂肪物質。它有助于構成細胞膜并保護哺乳 動物細胞受到外來物質的破壞。健康人的血清總膽固醇水平應低于200 高 膽固醇水平會導致致命的疾病，如動脈粥樣硬化、腦血栓形成、冠狀動脈心臟病和心肌梗 死，所以，分析開發一個高度敏感的膽固醇生物傳感器，特別膽固醇濃度的檢測，對臨床診 斷是很有意義的。
[0003] 最近，為了滿足病人的需要，膽固醇檢測技術發展迅速。有許多方法可以用來檢測 血漿中的膽固醇，如熒光法，高效液相色譜法和電化學法。而電化學生物傳感器因其成本 低、快捷、方便引起了極大關注。越來越多的研究人員致力于制備特殊修飾的電極用于膽固 醇的檢測。
[0004] 大部分膽固醇生物傳感器是基于過氧化氫(h2〇2)的電化學還原而制備的。例如，膽 固醇氧化酶(ChOx)和辣根過氧化物酶被修飾在生物傳感器上，進而催化產生過氧化氫和4-膽甾烯-3-酮即膽固醇的氧化還原產物。因此，在檢測膽固醇時，提高酶活性是最具吸引力 的。
[0005] 羧甲基纖維素(CMC)是一種良好的成膜材料，并且生物分子可牢固的吸附于纖維 素纖維上，從而固定。
[0006] 螺環材料因其具有兩個互相垂直的平面、無定形的性質和多個修改站點等性質而 極具吸收力。螺環化合物不僅表現出顯著的抗蛋白尿、抗肥胖、抗腫瘤特性，而且還可以應 用于不對稱催化、電化學傳感器、耐火材料、發光材料、光伏電池等。
[0007] 在過去的幾十年里，螺環化合物因其優秀的發光和電學性能被用作藍色磷光有機 發光器件(PhOLEDs)的宿主材料。眾所周知，制備好的電化學傳感器的關鍵在于電極的電學 性能。膽固醇傳感器應具有空穴傳輸能力、無色散和雙相載體運輸等屬性。近年來，標準的 電化學技術，如循環伏安法(CV)，是決定生物材料有效性的準確方法。本專利的目的是提出 一個新型的使用螺環化合物修飾的電極并用于膽固醇的檢測。
【發明內容】
[0008] 針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供了一種基于螺環材料的膽固醇生物 傳感器的制備方法，結合電化學技術，利用有螺環材料合成簡易、出色的電學性能和傳感器 制備簡單等特性，獲得工藝簡單、低成本的膽固醇生物傳感器的生產方式。
[0009] 為解決現有技術問題，本發明采取的技術方案為： 一種基于螺環材料的膽固醇生物傳感器的制備方法，包括以下步驟： 步驟1，取洗凈的導電基底，在其基底層的導電面上均勻涂布介質層，再在相對濕度為 30%-40%、溫度為18°C-28°C下干燥得半成品，其中介質層由螺環材料與生物粘合劑材料按 照體積比1:1-4混合后涂布而成； 步驟2，配制0.5-20mg · ml/1的膽固醇氧化酶溶液，取2-7yL的膽固醇氧化酶溶液均勻 涂布在介質層上，再在相對濕度為30%-40%、溫度為18°C_28°C下干燥形成酶層，即完成生物 傳感器的制備。
[00? 0]作為制備方法改進的是，所述的螺環化合物為2-氰基螺[荷-9，9 氧雜蒽](spiro [fluorene-9，9，-xanthene]-2-carbonitrile，CNSFX)、2，7-二氛基螺[荷-9，9，-氧雜蒽] (spiro[fluorene_9，9，-xanthene]_2，7-dicarbonitrile，DCNSFX)、2，-氛基螺[荷-9，9 氧雜蒽](spiro[fluorene_9，9，-xanthene]_2 '-carbonitrile，2 '-CNSFX)、2，，7，-二氛基 螺[荷_9，9，-氧雜蒽](spiro[fluorene_9，9，-xanthene]_2，，7 '-dicarbonitrile，2，，7 DCNSFX)、2，3 '，6 '，7-四氛基螺[荷-9，9 氧雜蒽](2，3 '，6 '，7- tetracarbonitrilespiro [fluorene-9，9 ' -xanthene]，TTCNSFX)、2 氛基螺[二苯并[c，h]氧雜蒽-7，9 荷](2 ' -carbonitrilespiro[dibenzo[c，h]xanthene_7，9'-fluorene]，CNSFDBX)、2 '，7二氛基螺 [二苯并[c，h]氧雜蒽-7，9'-荷](2',7dicarbonitrilespiro[dibenzo[c,h]xanthene-7，9 ' -f luorene]，DCNSFDBX)，且結構式如下所示：
作為制備方法改進的是，步驟1中介質層由螺環化合物的懸浮液與生物粘合劑溶液按 照體積比1:2混合后涂布而成。
[0011] 作為制備方法改進的是，步驟1中所述的生物粘合劑為羧甲基纖維素、殼聚糖或全 氟化膜。
[0012] 作為制備方法改進的是，步驟2中膽固醇氧化酶溶液的配制分為兩步:第一步，稱 取0.05-2mg的膽固醇氧化酶，溶于10yL，pH為5-9的磷酸緩沖液，得膽固醇氧化酶的儲備液； 第二步，取lyL的膽固醇氧化酶的儲備液，加入9yL，pH為5-9的磷酸緩沖液制成。
[0013] 作為膽固醇氧化酶溶液優選的是，第一步和第二步中所述磷酸緩沖液的pH均為7。
[0014] 有益效果 與現有技術相比，本發明具有的優勢有： 首先，傳統的用于檢測膽固醇的生物傳感器大多數使用的是膽固醇氧化酶(ChOx)和過 氧化物酶等的酶對，而本發明使用新型的螺環材料、螺環化合物可替代過氧化物酶，催化過 氧化氫分解，并收集、傳遞氧化氫分解產生的電子、加快酶促反應速率。
[0015] 其次，相對于傳統的兩酶系的生物傳感器，本發明只使用一種，既降低了傳感器的 成本，又提高了傳感器的穩定性。
[0016] 最后，本發明的傳感器，制備方法簡單、制備方面要求的環境寬松，對便攜式的家 庭及臨床膽固醇檢測設備的開發、推廣具有深遠意義。
[0017]
【附圖說明】
[0018] 圖1為基于螺環材料的膽固醇生物傳感器的結構示意圖，其中，1、基底層，2、介質 層，3、酶層； 圖2為基于螺環材料的膽固醇生物傳感器的檢測體系說明圖，其中，1、參比電極，2、對 電極，3、工作電極，即裸電極或螺環材料電極，檢測時，向柱形容器中加入緩沖液或膽固醇 溶液。
[0019] 圖3在50mVS4掃描速度的條件下，制備的螺環材料電極在pH為5.8、6.0、7.0、7.4、 8·0的含0· 1M KC1的5mM [Fe(CN)6] -4Λ3溶液中的循環伏安曲線，當溶液pH為7·0時，電極信 號最佳。
[0020] 圖4在50mVs-1掃描速度、溶液pH為7.0的條件下，制備的螺環材料電極DCNSroBX/ ΙΤ0在PBS(a)中和雙氧水溶液中（b)的循環伏安曲線； 圖5在δΟπιν^Γ1掃描速度、溶液pH為7.0的條件下，制備的螺環材料電極ChOx/DCNSFDBX/ ΙΤ0 在PBS(a)中、制備的螺環材料電極DCNSFD