用于檢測汞離子或半胱氨酸的電化學dna傳感器及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物傳感器技術領域，尤其涉及一種用于檢測汞離子或半胱氨酸的電 化學DNA傳感器及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 汞作為重金屬污染物之一，具有高毒性并對人體健康和生態系統有著嚴重危害 性。汞在環境中的存在形式有很多種，其中汞離子(Hg 2+)作為一種最常見和最穩定的存在形 式，廣泛地分布在各類水體中。世界健康組織(WHO)曾規定飲用水中汞離子總含量不能超過 0.001mg/L。由此可見，發明一種綠色環保、成本低廉且可以快速靈敏地檢測水體中的汞離 子濃度的傳感器是極其必要的。
[0003] 半胱氨酸(Cys)是一種含硫的自然氨基酸，在生物有機體內扮演著重要的角色，其 與生物體內蛋白質的合成有著密不可分的聯系。近些年來，Cys被發現可作為一種潛在的神 經毒素標志物，以及各種疑難雜癥如心臟病和AIDS的生理調節劑。因此對生物樣品內的Cys 進行定量檢測也顯得極其重要。
[0004] 目前，關于檢測汞離子和Cys的方法有很多，其中傳統的檢測技術包括原子吸收/ 發射光譜法（AAS/AES)、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS)、冷蒸汽原子熒光光譜法 (CVAFS)、高效液相色譜法(HPLC)以及毛細管電泳法等，這些方法雖然有較高的精確度和靈 敏性，但往往樣品制備復雜且耗時長，要求專業的操作人員且機器笨重、成本高。近些年來， 伏安法、熒光法等一系列新的方法被研究用來檢測汞離子和Cys，而電化學方法由于其獨特 的優勢如方便攜帶、靈敏度高等已被廣泛研究并應用于檢測重金屬離子或有機物分子。 [0005]現今，隨著電化學技術及生物傳感技術的日益成熟，各式各樣的電化學生物傳感 器已經被研發并用于檢測各種目標物質，其中電化學DNA傳感器便是目前研究比較廣泛的 一種傳感器之一。這些傳感器中的大部分有著良好的線性范圍和低的檢測極限，然而它們 中大多數只針對一種目標對象，不能用來檢測多種物質。為了提高傳感器的利用效率，發明 一種可以檢測多種目標物質的傳感器也是極其必要的。此外，在構建電化學生物傳感器的 過程中，工作電極作為其中重要的一部分，如何提高它的穩定性和電子傳導能力也是研究 的熱點和重點。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種能夠檢測兩種目標物 質、穩定性高、使用壽命長、抗干擾能力強、檢測范圍寬、檢測極限低的用于檢測汞離子或半 胱氨酸的電化學DNA傳感器，并相應提供一種簡單安全，成本低，制作快速的電化學DNA傳感 器的制備方法，在此基礎上，還提供一種上述電化學DNA傳感器的應用，該應用能夠以低的 檢測極限及較強的抗干擾性分別實現對汞離子和半胱氨酸的檢測。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：
[0008] -種電化學DNA傳感器，包括在三電極體系中用作工作電極的玻碳電極，所述玻碳 電極反應端表面修飾有包括自摻雜聚苯胺納米纖維、有序介孔碳和金納米粒子的組成的復 合膜，所述復合膜表面自組裝有DNA捕獲探針，所述DNA捕獲探針的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1的DNA序列。進一步優選的，所述自摻雜聚苯胺納米纖維、有序介孔碳和金納米粒子從 內至外依次排列于所述玻碳電極反應端表面形成復合膜。進一步優選的，所述DNA捕獲探針 可通過T-Hg 2+-T結構錯配形成發夾結構。
[0009] 作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種上述的電化學DNA傳感器的制備方 法，包括以下步驟：
[0010] S1、修飾自摻雜聚苯胺納米纖維:在玻碳電極反應端表面滴加自摻雜聚苯胺納米 纖維懸浮液，得到自摻雜聚苯胺納米纖維修飾的玻碳電極；
[0011] S2、修飾有序介孔碳:在所述步驟S1得到的自摻雜聚苯胺納米纖維修飾的玻碳電 極反應端表面滴加有序介孔碳懸浮液，得到有序介孔碳/自摻雜聚苯胺納米纖維修飾的玻 碳電極；
[0012] S3、電沉積金納米粒子:在所述步驟S2得到的有序介孔碳/自摻雜聚苯胺納米纖維 修飾的玻碳電極反應端表面電沉積金納米粒子，得到金納米粒子/有序介孔碳/自摻雜聚苯 胺納米纖維修飾的玻碳電極；
[0013] S4、自組裝DNA捕獲探針:在所述步驟S3得到的金納米粒子/有序介孔碳/自摻雜聚 苯胺納米纖維修飾的玻碳電極反應端表面滴加 DNA捕獲探針進行反應，使所述DNA捕獲探針 通過金硫共價鍵固定在所述玻碳電極反應端表面，完成所述電化學DNA傳感器的制備。
[0014] 上述的制備方法，優選的，所述步驟S1中的自摻雜聚苯胺納米纖維采用一步化學 氧化法合成。進一步優選的，所述化學氧化法的具體步驟為：將溴化十六烷基三甲銨 (CTAB)，苯胺(AN)，2_氨基苯磺酸(ABS)溶解于鹽酸溶液中，然后加入過硫酸銨(APS)溶液， 在5°C下反應24h得到自摻雜聚苯胺納米纖維。進一步優選的，所述CTAB、AN、ABS的質量比為 0.22:0.46:0.86。所述過硫酸銨的濃度為0.06M。
[0015] 上述的制備方法，優選的，所述步驟S2中的所述有序介孔碳采用以下方法制備得 到：
[0016] S2-1.合成硅基分子篩SBA-15:將嵌段共聚物P123和正硅酸乙酯混合后在140°C~ 150 °C下水浴，然后焙燒得到硅基分子篩SBA-15;
[0017] S2-2.合成有序介孔碳:所述硅基分子篩SBA-15與水、蔗糖、濃硫酸混合得到混合 物，將所述混合物置于100°c~160 °C溫度下干燥直至混合物變為黑色，然后將黑色的混合 物置于惰性氣體保護下進行高溫熱解得到熱解產物，將所述熱解產物經過洗滌、干燥等步 驟得到所述有序介孔碳。
[0018]上述的制備方法，優選的，所述步驟S3中，采用計時電流法將所述金納米離子沉積 在所述有序介孔碳/自摻雜聚苯胺納米纖維修飾的玻碳電極反應端表面，所述計時電流法 的沉積電位為〇. 2V，沉積時間為60s~150s。
[0019]上述的制備方法，優選的，所述步驟S4具體為：在所述步驟S3得到的金納米粒子/ 有序介孔碳/自摻雜聚苯胺納米纖維修飾的玻碳電極反應端表面滴加 DNA捕獲探針，在4°C 下反應12h;然后轉入6-巰基乙醇(MCH)溶液中培養0.5h~1 h，完成所述電化學DNA傳感器的 制備。進一步優選的，所述DNA捕獲探針的濃度為ΙμΜ~5μΜ。所述6-巰基乙醇的濃度為ImM。
[0020] 作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種所述的電化學DNA傳感器或采用所 述制備方法制得的電化學DNA傳感器在檢測汞離子中的應用。
[0021] 上述的應用，優選的，所述檢測汞離子的應用方法包括以下步驟：
[0022] (1)將所述電化學DNA傳感器的玻碳電極反應端浸泡在含汞離子的待測溶液中反 應，使所述電化學傳感器上的DNA捕獲探針與待測溶液中的汞離子形成T-Hg 2+_T錯配；
[0023] (2)將所述電化學DNA傳感器轉入含信號指示劑AQDS的溶液中，使所述AQDS插入 DNA雙鏈中；
[0024] (3)以經過所述步驟(2)處理過后的玻碳電極作為工作電極，置于含NaCl的PBS緩 沖液中，建立三電極系統，將所述三電極系統與電化學工作站連接，采用差分脈沖伏安法測 試;根據汞離子濃度與峰電流變化關系構建檢測線性回歸方程，根據線性回歸方程計算待 測溶液中的汞離子濃度。
[0025] 上述的應用，優選的，所述步驟(1)中，所述反應時間為lh~2h。
[0026] 上述的應用，優選的，所述步驟(2)中，所述反應時間為6h~8h。
[0027] 上述的應用，優選的，所述步驟(3)中，所述緩沖溶液是在0.05M 1?緩沖溶液中加 入NaCl得到的roS緩沖溶液，緩沖溶液中含0.2M~0.5M NaCl，緩沖溶液的PH值為7.0。進一 步優選的，緩沖溶液中含0.3M NaCl。
[0028] 上述的應用，優選的，所述汞離子濃度與峰電流變化關系的檢測線性回歸方程為：
[0029] yi = -9.147x1+164.597 (1)
[0030] 式中，yi表示峰電流與背景峰電流的差值，即ΔΙρ，單位為μΑ;Χ1為待測溶液中汞離 子濃度負對數值，即-l〇g[Hg 2+]，汞離子濃度的單位為Μ;式⑴的相關系數R2 = 0.9934,萊離 子