定量分析微塑料在哺乳動物體內富集和分布的方法
【技術領域】
[0001]本發明設計一種微塑料健康風險評價方法，更具體來說就是一種基于熒光標記技術定量分析微塑料在哺乳動物體內富集和分布規律的方法，即一種基于現代熒光技術分析微塑料這種新興污染物在哺乳動物體內富集和分布的新型檢測方法。
【背景技術】
[0002]眾所周知，塑料這種材料在當今生活中的重要作用。各種塑料制品在給人們生活帶來各種便利的同時，也帶來了各種潛在健康風險，其中最突出就是塑料制品在被丟棄后經過一定的物理、化學、生物等作用，會變成顆粒越來越小的塑料顆粒一一微塑料。但是這種塑料顆粒不會被自然環境降解，而是一直存留在環境中，甚至會進入生物體內，帶來環境健康風險。在評價微塑料的健康風險過程中，急需準確、靈敏、方便快捷的方法來檢測微塑料在生物體內的富集和分布規律，這是準確評估微塑料健康危害的基本前提。
[0003]目前的研究多集中在證明微塑料是否能進入生物體內，其方法可總結為:水生動物進行一定量的微塑料暴露，然后采用高倍顯微鏡或者偏振光檢測儀器檢測生物體內是否具有微塑料。然而，這些研究主要針對水生生物，對哺乳動物體內微塑料含量缺乏有效的檢測方法，且這些方法通常只能定性分析，不能進行準確的定量，也無法得到微塑料在不同組織器官的富集和分布規律。
[0004]因此，急需一種簡單、靈敏、準確定量分析微塑料在哺乳動物生物體內富集和分布規律的方法。本發明整合材料合成技術和熒光檢測技術，可以有效的采用熒光微塑料對模式動物進行暴露實驗，準確進行生物體內微塑料含量的檢測，為微塑料健康風險評價奠定基礎。
【發明內容】
[0005]針對現在普遍缺乏對哺乳動物體內微塑料含量準確定量的方法，本發明提供一種基于熒光技術分析體內微塑料含量的方法，即基于熒光微塑料的制備和熒光檢測方法結合的生物學檢測方法，通過本發明可以對不同粒徑的微塑料在生物體內分布及其富集規律進行準確的定量分析，為后續的微塑料毒性評價提供基礎數據。
[0006]具體來說，本發明采用了以下技術方案:
一種定量分析微塑料在哺乳動物體內富集和分布的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
(1)熒光微塑料顆粒的制備:首先配制10_20mL的三氯甲烷與異丙醇1:1體積比的混合溶劑，然后稱取0.1-0.2g交聯聚苯乙烯微球和5-10mg的4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑加入上述混合溶劑中，并在超聲和氮氣保護條件下分散溶解，充分溶解后的混合液體進行干燥，然后用于50-70%乙醇洗滌以去除多余熒光染料，接著離心回收熒光微塑料，制備出帶綠色熒光的PS微球；
(2)哺乳動物暴露實驗:選擇上述合成的熒光標記微塑料作為受試樣品，選取模式哺乳動物進行灌胃染毒實驗，以健康哺乳動物作為空白對照組；
(3)樣品采集:熒光微塑料染毒周期結束以后，受試動物解剖，采集組織樣品；
(4)冷凍干燥組織樣品:使用冷凍干燥儀，分別冷凍干燥空白組和染毒組的組織樣品至恒重；
(5)濕法消解樣品:稱取一定量的凍干組織樣品，采用濕法消解組織樣品；
(6)熒光定量檢測微塑料含量:采用空白組動物的組織消解液，加入已知含量的熒光微塑料，制備不同濃度梯度的懸濁液，在設定的最大激發波長和最大發射波長下，用熒光光譜儀檢測其熒光值，以熒光強度和對應的微塑料濃度繪制出標準曲線，然后檢測暴露組組織消解液的熒光值，根據標準曲線確定組織液微塑料濃度，并換算出各組織中微塑料含量。
[0007]其中，在步驟(I)中，超聲分散條件為在100W超聲下處理15-20分鐘，干燥條件為真空干燥箱中在0.151^&、32°035°(:下干燥12-16小時，以50-70%乙醇洗滌并隨后在6000印111/min下離心10-20分鐘，洗滌和離心重復3-5次，以回收制備出的綠色熒光PS微球。
[0008]在步驟(2)中，模式哺乳動物為大鼠或小鼠，染毒實驗的染毒周期為一周。
[0009]另外，在步驟(3)中，所采集的組織樣品為肝臟、腎臟、小腸或其組合。
[0010]進一步，在步驟(4)中，凍干條件為在-10大氣壓和_50°C條件下冷凍干燥組織樣品至恒重。
[0011 ]其中，在步驟(5)中，稱取一定量的凍干組織樣品，采用濕法消解組織樣品，具體消解條件為每0.1克組織樣品中加入I毫升的65%V/V硝酸，70°C水浴2小時，然后加入與硝酸等體積的30%V/V雙氧水，850C水浴2小時，消解結束后，消解液呈現淡黃透明，定容到10毫升。
[0012]在步驟(6)中，設定的最大激發波長為445nm，最大發射波長為550nmo
[0013]有益效果
本發明基于熒光微塑料合成技術和熒光微塑料檢測技術，提供一種基于熒光標記技術定量分析微塑料在哺乳動物體內富集和分布規律的方法，填補了當今尚無便捷、準確定量分析微塑料在哺乳動物體內富集和分布檢測方法的空缺，為后續微塑料的環境健康風險甚至是人體健康風險評價提供準確的基礎數據。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明方法的流程圖；
圖2為本發明的熒光微塑料在熒光顯微鏡以及掃描電鏡下的照片；
圖3至圖8為本發明的熒光定量檢測的標準曲線；
圖9為本發明的暴露組哺乳動物各組織器官中微塑料的含量。
【具體實施方式】
[0015]本發明是一種基于熒光標記技術定量分析微塑料在哺乳動物體內富集和分布規律的方法，其具體步驟如下:
(I)熒光微塑料制備:首先，配置三氯甲烷和異丙醇的混合溶劑10-20mL(l:l)，然后稱取0.1-0.2g的交聯聚苯乙烯(PS)微球和5-10mg的熒光染料4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑(NBD-CL)加入上述混合溶劑中，并在超聲(15-20min，100W)和氮氣保護條件下分散溶解。充分溶解后的混合液體置于真空干燥箱中(32 oC-35oC,0.15Mpa)干燥12_16h，待溶液干燥后，用50%-70%乙醇洗滌聚苯乙烯微球去除多余熒光染料，接著使用離心機(10-20min，6000rpm/min)離心出熒光微塑料(洗滌和離心過程重復3-5次)。此方法可以制備出帶綠色熒光PS微球。
[0016](2)哺乳動物暴露實驗:以制備的已知粒徑的熒光微塑料為受試樣品，選取模式動物(如小鼠、大鼠等模式哺乳動物)進行灌胃暴露實驗(空白組模式動物不進行暴露實驗)，每個實驗組10只模式動物，染毒時間一周，以健康哺乳動物作為空白對照組；
(3)樣品采集:暴露周期結束后，解剖模式動物，采集肝臟、腎臟和小腸等組織器官，并記錄相應的質量，然后轉移到超低溫冰箱；
(4)冷凍干燥組織樣品:從超低溫冰箱中轉移出組織至冷凍干燥儀(LABCON⑶，USA)，在-10大氣壓和-50°C條件下冷凍干燥組織樣品至恒重；
(5)濕法消解組織樣品:分別稱取經冷凍干燥的動物組織樣品0.1克，加入I毫升硝酸(65%，V/V)，70°C水浴2小時，加入I毫升的雙氧水(30%，V/V)，85°C水浴2小時，消解結束后消解液呈現淡黃透明狀態，定容到1毫升。
[0017](6