檢測血小板衍生長因子的熒光增強微陣列傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術及臨床醫學診斷領域，涉及一種新型檢測血小板衍生長因子 (PDGF-BB)的熒光增強微陣列傳感器及應用。基于原位合成的金屬納米顆粒-聚二甲基硅氧 烷(PDMS)混雜膜，作為具有熒光增強效應的生物微陣列傳感器基底材料，在這基底上進行 表面胺基化修飾及表面涂層并結合適配體捕獲目標分析物，可以大大提高表面的熒光信號 強度，從而實現對血小板衍生長因子等生物分子的高靈敏、高選擇性檢測。
【背景技術】
[0002] 基于金屬表面等離子體熒光增強效應(MEF)的研究最近持續受到關注，當光在金 屬和電介質面上沿一個方向平行地傳播時，金屬表面的自由電子在一定頻率的外界電磁場 作用下規則運動而產生表面等離子體共振，這種共振可極大地增強金屬粒子周圍的電磁 場，這種表面局域電磁場的增強使靠近金屬粒子表面的熒光物質的激發效率明顯提高，導 致焚光增強效應的產生。[參見（a)J.R. Lakowicz，K · Ray，M. Chowdhury，H · Szmacinski， Y.Fu,J.Zhang,K.Nowaczyk,Analyst,2008,133,1308.(b)C.R.Sabanayagam,& J.R.Lakowicz，.Nucleic Acids Res.2006,35，el3.]該熒光增強效應的產生強烈依賴于熒 光物質和金屬表面之間的距離，若發光物質與產生等離子體的金屬表面直接接觸，則會導 致熒光物質熒光淬滅;如果兩者之間的距離太大，則不顯示任何相互作用，因此合適的距離 是產生這種熒光增強效應的關鍵，而這種有效距離取決于材料的組成及性質。[參見（a) J. Zhang,Y.Fu,Y.P.Mei,F.Jiang and J.R.Lakowicz,Anal.Chem.2010,82,4464-4471.(b) K. Aslan, I .Gryczynski ,J.Malicka,E.Matveeva,J.R Lakowicz , C.D.Geddes..Curr.Opin.Biotechno1.2005,16,55-62.]
[0003] 適配體(Aptamer)是一種具有三維空間結構、能特異性識別目標蛋白的DNA或RNA 分子，具有合成簡單、易于修飾且穩定性良好等特點。[參見（a)E . J . Cho，J . -W . Lee， A.D.Ellington,Rev.Annu.,Anal.Chem.2009,2,241-264.(b)T.Nguyen,J.Hilton,Q.Lin., Microfluid.Nanofluid. 2009，6，347-362.]因此可以利用不同的適配體實現對目標生物蛋 白的特異性識別。
[0004] 微陣列生物傳感器是一種被廣泛應用于基因、蛋白、糖類、細胞以及其他生物組分 的高通量分析方法，其原理為在活化的固體基質上利用機械或化學的方法制備各種生物分 子包括DNA、糖類、蛋白質等的矩陣排列，然后通過分子間的特異性相互作用對各種生命物 質進行分析檢測。[SM(a)G.MacBeath，.Nat.Genet.2002,32,526-532.(b).J.Madoz-Gurpide，Η·Wang，D·Ε.Misek，F.Brichory，S.M.Hanash.，Proteomics·2001，1，1279-1287·] 微陣列生物傳感器雖然在二十世紀末才剛剛起步，但如今已在基因表達、疾病檢測、環境監 測、預防醫學、食品監督等諸多領域均有貢獻，具有廣闊的應用前景。
[0005] 通過對表面等離子體熒光增強效應與微陣列生物傳感器的完美結合，可以達到顯 著提高檢測靈敏度的目的。其中，構建具有表面等離子體熒光增強效應的貴金屬顆粒表面 及控制熒光物質和金屬顆粒表面之間的距離是其關鍵所在。已經有包括熱蒸發法[參見 J·R.Lakowicz，Y·Shena，S·D'Auria，J.Maiicka，J·Fang，Z.Gryczynski，I·Gryczynski， Anal .Biochem. 2002，301，261]、化學沉積法[參見J.R.Lakowicz，Anal.Biochem. 2001，298， 1 ·]、光誘導沉積法[C·D·Geddes，A.Parfenov，D· Roll，J·Fang，J· R. Lakowicz，Langmuir 2003,19,6236.]、電化學沉積法等多種制備等離子體熒光增強效應金屬表面，但都面臨著 操作步驟多、重復性不好，操作復雜以及需要昂貴儀器的問題。
[0006]血小板衍生長因子（platelet-derived growth factor JDGF-BB)是一種人血小 板生長因子蛋白，可由多種血細胞、組織細胞和一些腫瘤細胞產生，參與促成纖維細胞、膠 質細胞、平滑肌細胞的生長。PDGF-BB是原癌基因 c-sis的編碼產物，其自分泌活動異常增加 可促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡，是一種優良的腫瘤標志物，目前對腫瘤細胞中PDGF表 達及在生物體液中檢測已成為生物醫學研究領域的熱點。[參見：（a)R.H.Cao，M.A. Bjomdah, P.Religa,S.Clasper,S.Garvin,D.Gaiter,B.Meister,F.Ikomi,K.Tritsaris, S.Dissing，T.0hhashi，D.G.Jackson，Y.H.Cao，Cancer Cell.2004，6(4)，333_345;(b) R. H. Cao ,E .Brakenhielm,R. Pawl iuk, D. ffariaro ,M. J. Post ,E .ffahlberg ,P . Leboulch , Y.H.Cao,Nature Medicine,2003,9,604-613.]
[0007] 目前檢測血小板衍生長因子(platelet-derived growth factor JDGF-BB)主要 采用酶聯免疫吸附分析法。然而這種方法需要抗體和酶標蛋白，因此價格昂貴；同時操作步 驟非常多，非特異性反應嚴重，檢測時間長達3~5小時。因此，發展快速、簡單和靈敏的生物 檢測血小板衍生長因子技術在生物研究和臨床診斷上具有重要意義。
【發明內容】
[0008] 為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種檢測血小板衍生長因子的熒光 增強微陣列傳感器，基于原位合成的貴金屬納米顆粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混雜膜作為 具有熒光增強效應的生物微陣列傳感器基底材料，在此基底上進行表面胺基化修飾及表面 涂層并結合適配體捕獲目標生物大分子，該薄膜中的貴金屬納米顆粒引起的表面等離子體 熒光增強效應使得表面的熒光信號強度大大增強，能夠實現對生物大分子的高靈敏度、高 選擇性檢測。
[0009] 采用的技術方案：
[0010] -種基于金屬納米顆粒膜的熒光增強微陣列傳感器，所述的微陣列傳感器包括帶 有孔道的多孔板、金屬納米顆粒膜及捕獲生物大分子功能單元。所述的帶有孔道的多孔板 可以為市售的96孔板或384孔板，孔管容積為100~400yL，孔板材質為聚烯烴;所述的貴金 屬納米顆粒膜為在多孔板孔底部原位共合成的金屬納米顆粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混雜 膜，功能化的貴金屬納米顆粒分散在膜表面，直徑為20~lOOnrn;所述的捕獲生物大分子功 能單元是通過在貴金屬納米顆粒膜表面包覆(聚賴氨酸/聚丙烯酸) n涂層，涂層厚度η為1~ 10層，在涂層表面結合能夠捕獲目標生物大分子的適配體，適配體序列為5'TAMRA-CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TG-3'，其中TAMRA為結合在適配體上的有機熒光 染料。
[0011] 制備所述的基于貴金屬納米顆粒膜的熒光增強微陣列傳感器，按以下步驟進行： [0012 ](1 )、貴金屬納米顆粒-聚二甲基硅氧燒(PDMS)混雜膜的制備:在多孔板96孔板或 者384孔板孔底部加入TOMS單體及相應的固化劑，總體積控制在50~200yL，H)MS單體及固 化劑的質量比為20:1~2:1，去除氣泡后在50~120 °C條件下反應30~120min，然后加入50 ~200yLHAuCl4或者AgN03水溶液，AgN03水溶液或者HAuCU水溶液的質量比為0.2%~ 2.0%，繼續在溫度5~40°C條件下反應20~72小時，反應完成后用大量無水乙醇洗去未反 應完的AgN0 3水溶液或者HAuC14水溶液，然后在20~60°C下干燥，即可得到Ag或Au金屬納米 顆粒聚二甲基硅氧烷(PDMS)混雜膜。
[0013] (2)、貴金屬納米顆粒混雜膜的表面修飾:在步驟（1)所制得的金屬納米顆粒混雜 膜為基底的孔道中加入50~200yL巰基乙胺的乙醇溶液，巰基乙胺溶液濃度為ImM~1 OmM， 在5~40 °C下反應10~48小時，用大量無水乙醇沖洗，再換成去離子水沖洗，在20~60°C下 烘干。然后在此膜表面包覆(聚賴氨酸/聚丙烯酸)η涂層，以聚丙烯酸作為開始層，再包覆聚 賴氨酸涂層，涂層厚度η為1~10層。具體做法如下：在膜表面首先加入50~200yL的聚丙稀 酸水溶液，聚丙稀酸水溶液的質量濃度為lmg/ml~10mg/ml，在5~40°C條件下反應5~60分 鐘，然后用大量去離子水洗滌以及在10~40 °C條件下干燥;接著在此表面再加入50~200yL 的聚賴氨酸水溶液，聚賴氨酸水溶液的質量濃度為：lmg/ml~10mg/ml，在5~40 °C條件下反 應5~60分鐘，然后用大量去離子水洗滌以及在10~40°C條件下干燥，這樣就形成一層（聚 賴氨酸/聚丙烯酸)涂層，按照相同的方法就可以制備得到η層(聚賴氨酸/聚丙烯酸)涂層。
[0014] (3)、表面修飾后的金屬納米顆粒混雜膜結合能夠捕獲目標生物大分子的適配體： 在步驟(2)修飾后的金屬納米顆粒混雜膜孔道中加入50~200yL適配體水溶液，適配體序列 為5'TAMRA-CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TG-3'，其中TAMRA為結合在 適配體上的有機熒光染料。適配體水溶液濃度為ΙΟΟηΜ~ΙΟΟΟηΜ，在30~90°C條件下反應30 ~120min，反應完成后剩余的溶液用移液槍吸取，然后用pH 7.4的PBS緩沖溶液洗滌3~6 次。
[0015] 所述基于金屬納米顆粒混雜膜的熒光增強微陣列傳感器應用于生物大分子血小 板衍生長因子檢測的方法步驟包括:50~200yL的樣品溶液加入所述的熒光增強微陣列傳 感器孔道內，在20~50°C條件下孵育30~120分鐘，然后用移液槍吸取未反應掉的溶液，加 入50~200yL pH7.4的roS緩沖溶液輕輕地洗滌，吸取洗滌液，最后進行熒光酶標儀定量分 析。
[0016] 與現有的生物大分子酶聯免疫吸附分析法相比，本發明所提供的基于金屬納米顆 粒膜的熒光增強微陣列傳感器具有以下優點：
[0017] (1)無需特定的抗體及酶標蛋白，試劑用量少。而酶聯免疫分析法需要抗體和酶標 蛋白，因此價格昂貴。
[0018] (2)操作步驟少，屬于"一步法"檢測。而酶聯免疫分析法需要抗原、抗體的包被、孵 育、洗滌及染色，分析步驟多，在此過程中容易出錯。
[0019] (3)檢測時間短，在半小時內就可完成。而酶聯免疫分析法分析步驟多，需要長達3 ~5小時的檢測時間。
[0020] (3)穩定性好，可以長時間保存，檢測性能不下降。
[0021 ] 在完成發明的過程中，選擇血小板衍生長因子（platelet-derived growth factor，roGF-BB)作為檢測目標物，對所述的基于金