一種獲取剪切場下單個聚合物分子擴散以及定向運動信息的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種獲取剪切場下單個聚合物分子擴散以及定向運動信息的方法，屬 于高分子物理基礎研究領域。
【背景技術】
[0002] 測量聚合物分子在其良溶劑中的擴散信息一直是高分子物理領域的重要基礎性 研究工作。聚合物分子在其良溶劑中的擴散與其分子構象有著密切的聯系，這方面的研究 不僅將幫助我們更好的理解聚合物溶液宏觀性質的微觀物理過程，也將幫助我們理解一些 生命過程的微觀物理本質。
[0003] 擴散大體可以分為本體擴散和界面擴散或者二維受限擴散。對于本體擴散中國科 學院化學研究所韓志超等用激光動態光散射技術成功的得到了聚合物分子在半稀溶液中 的自擴散和協同擴散信息（Eric J.Amis, Charles C.Han.Cooperative and self-diffusion of polymers in semidilute solutions by dynamic light scattering， Polymer，1982,23:1403-1406)，George B.Benedek等人用去極化光散射技術成功的得到了 生物大分子在溶液中的旋轉擴散信息（Stuart B.Dubin, Noel A .Clark and George B.Benedek.Measurement of the Rotational Diffusion Coefficient of Lysozyme by Depolarized Light Scattering:Configuration of Lysozyme in Solution， J.Chem.Phys.，1971，54:5158-5164);對于界面擴散或者二維受限擴散中國科學院化學研 究所趙江等用全內反射單分子熒光成像技術成功的測得了超薄膜體系結晶前后單個分子 鏈的擴音夂信息（Rui Chen,Lin Li and Jiang Zhao . Single Chain Diffusion of Poly (ethylene oxide)in Its Monolayers before and after Crystallization,Langmuir, 2010,26:5951-5956)。
[0004] 然而，全內反射單分子熒光成像技術對于慢擴散體系(凝膠、薄膜等)可以很好的 從單分子的角度獲得其擴散信息，但是對于快擴散體系（聚合物稀溶液等)就喪失了活力； 光散射技術可以很好的得到中性聚合物分子的擴散信息，但是由于受到聚合物濃度以及散 射截面的限制，不適合多電荷體系的擴散的測量，因此不能夠滿足多電荷體系研究的需要。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供獲取剪切場下單個聚合物分子擴散以及定向運動信息的方 法，該方法既可以實施精確的動態剪切，而且具有單分子級別的分辨率和靈敏度，同時適用 于中性體系和多電荷體系。
[0006] 本發明提供的一種獲取剪切場下單個聚合物分子擴散以及定向運動信息的方法， 包括如下步驟：
[0007] (1)配制濃度為1〇ηΜ以下的聚合物溶液，將熒光分子探針標記在聚合物分子上；
[0008] (2)在施加剪切場的同時，激光照射經標記的聚合物溶液，收集發射出的熒光信 號，即可得到單個聚合物分子擴散以及定向運動信息;所采用的測量系統包括:一用于作為 激發光照射待測樣品的激發光源單元;一用于對待測樣品施加機械剪切同時測量其宏觀流 變學特性的剪切施加與流變測量單元，所述剪切施加與流變測量單元底部設置一激發光光 學窗口；以及一光學顯微單元，所述光學顯微單元用于將所述激發光源單元出射的激發光 經所述激發光光學窗口引入到位于剪切場下的待測樣品，使得待測樣品受激發產生熒光信 號，并將產生的熒光信號收集發射到一熒光關聯光譜測量單元;所述熒光關聯光譜測量單 元用于獲取熒光信號，得到單個聚合物分子的擴散以及定向運動信息。
[0009] 上述的測量方法中，所述測量系統中，所述剪切施加與流變測量單元采用一轉矩 流變儀，所述轉矩流變儀下基板設置所述激發光光學窗口，所述激發光光學窗口具體可為 一石英載玻片，其厚度為〇. 13~0.17_，從而使光學窗口具有高透過率和短工作距離;在測 試過程中將待測的聚合物溶液滴加到該載玻片上測量，具體可滴加0.8~1.2mL(如lmL)，由 于聚合物溶液的濃度小于1〇ηΜ(如5nM)，微小的激發空間內平均存在單個或者少于單個熒 光分子，因此可得到單個聚合物分子的熒光關聯光譜。
[0010] 上述的測量方法中，所述測量系統中，所述激發光源單元包括若干激光器、若干反 射鏡、若干光闌、第一擴束鏡和第二擴束鏡，第二擴束鏡的入射端可以設置一用于調節激發 光的功率的中性密度濾波片;所述激發光源單元可以采用連續激光或飛秒脈沖激光，目的 是激發更多種熒光分子，所選擇激光器的波長需要與所激發的熒光探針相匹配;從所述激 光器發射的激光分別依次分別經若干反射鏡反射或透射和所述光闌并依次經第一擴束鏡 和第二擴束鏡進行兩級擴束將激光光束直徑擴大到2.0cm左右以確保其尺寸大于光學顯微 單元的顯微鏡物鏡進光孔，從而獲得充分利用物鏡的數值孔徑而產生最小的激發空間（達 10 一 15L 級別）。
[0011] 上述的測量方法中，所述測量系統中，所述測量系統中，所述光學顯微單元采用倒 置焚光顯微鏡，包括一顯微鏡物鏡、一二向色鏡、一發射光高通濾波片、一激發光帶通濾波 片、一針孔、一分束鏡和一聚焦透鏡，所述激發光經所述顯微物鏡發射到位于所述剪切施加 與流變測量單元內部的待測樣品，經待測樣品激發的熒光經所述顯微物鏡收集后發射到所 述二向色鏡，經所述二向色鏡出射的熒光信號經所述發射光高通濾波片和針孔發射到分束 鏡，經分束鏡出射的一部分光經所述聚焦透鏡發射到所述熒光關聯光譜測量單元;另外，所 述激發光源單元的出射端設置所述激發光帶通濾波片。
[0012] 上述的測量方法中，所述測量系統中，為了有效消除探測器本身的after-pulsing 產生的假信號，所述測量系統還包括一第二熒光關聯光譜測量單元、一反射鏡和一聚焦透 鏡，經所述分束鏡出射的另一部分光經所述反射鏡反射到所述聚焦透鏡，經所述聚焦透鏡 出射的光發射到所述第二熒光關聯光譜測量單元。
[0013] 上述的測量方法中，所述測量系統中，熒光關聯光譜測量單元均包括一單光子探 測器以和一數據采集卡，單光子探測器將探測接收的熒光信號轉換為電信號經數據采集卡 發送到一計算機進行關聯性分析以及關聯函數的擬合，從而獲得待測樣品的擴散信息及定 向運動信息。
[0014] 上述的測量方法中，所述測量系統還包括一高精度位移平臺，使用時可以將轉矩 流變儀放置在顯微鏡物鏡的上方，從而實現各個器件的精確聯動。
[0015] 上述的測量方法中，所述熒光分子探針以化學鍵合的方式標記在所述聚合物分子 上，如聚合物分子鏈的末端。
[0016]上述測量方法中，所述聚合物可為DNA，具體可為人體單鏈DNA i-motif片段，序列 為5 '-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3 '。
[0017] 上述測量方法中，所述熒光分子探針可為熒光染料，具體可為Oregon Green 514， 其最大吸收波長為514nm，結構式如式I所示：
[0018]
[0019]上述的測量方法中，所述方法在所述標記之前還包括在所述DNA分子的5'端修飾 NH2-(CH2)6-的步驟，使得熒光分子探針中的琥珀酰亞胺酯鍵與DNA分子末端修飾的氨基反 應從而使熒光分子探針結合在DNA分子上。
[0020]上述的測量方法中，所述標記中，所述DNA與所述熒光染料的摩爾比為1: (3~7)， 具體可為1:5。