抗原檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及病毒檢測技術領域，具體是一種丙型肝炎病毒NS3抗原檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒化epatitis C virus,肥V)感染而引起的嚴重威脅人 類健康的傳染性疾病。全球約有1.3-1.7億HCV感染者，大約20 %可W自然清除，80%發展為 HCV慢性感染。10-20 %的HCV慢性感染會進一步發展為慢性進行性肝病，包括肝硬化、肝細 胞癌等。HCV是一種非甲非乙型肝炎病毒，后命名為丙型肝炎病毒，歸屬于肝炎病毒屬 化epacivirus)，黃病毒科(Flaviviridae)。HCV病毒體呈球形，為單股正鏈RNA病毒。HCV- RNA全長約為9.化b，包括一個位于基因中央的開放閱讀框(0RF)。該閱讀框編碼3000多氨基 酸的前體多聚蛋白，其通過宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10個具有獨立功能的HCV蛋 白，根據功能的不同分別命名為核屯、蛋白Core(C)，包膜蛋白（envelope proteinHJ化1、 E2)，p7和非結構蛋白（non s1:;ruc1:ural p;rotein)NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。NS3蛋白是 HCV病毒復制中重要的功能蛋白之一，發揮絲氨酸蛋白酶，解旋酶和ΝΤΡ酶活性，成為當今 HCV診斷，治療和預防的研究熱點。
[0003] 由于多數丙肝患者不出現明顯的臨床癥狀，大部分病人直到出現肝硬化甚至肝癌 時，才發現自己患有丙肝。因此早期診斷、早期治療非常重要。
[0004] 目前我國阻斷丙型肝炎傳播的主要方法是：1、酶聯免疫吸附法化LISA)檢測丙型 肝炎抗體(抗-HCV)篩選供血員，然而抗-HCV的出現是在HCV感染后的6-12周(窗口期），所W 抗-HCV陰性并不能排除攜帶HCV具有傳染性的可能，存在漏檢的可能性。2、HCV-RNA檢測存 在W下問題:價格昂貴，國產為200元，進口為400元。3、由于RNA易降解，易出現假陰性，因此 對樣本要求高；易出現假陰性、假陽性結果，對檢測人員的要求高。
[0005] 目前國內已有的丙肝抗原檢測只針對核屯、抗原化CV-CAg)，HCV核屯、抗原的檢測也 可縮短肥V診斷的"窗口期"，然而核屯、抗原是HCV結構區的一部分，檢出率低，若能對非結構 區抗原進行聯合檢測，可能將提高檢出率。
[0006] 血清中可存在游離的非結構蛋白NS3,其保守性相對較高，可用于血清學診斷。本 公司產品丙型肝炎病毒NS3抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法），針對丙肝非結構蛋白NS3,聯合上 述檢測方法可W避免丙型肝炎篩查漏診的發生，縮短窗口期，具有早期診斷丙型肝炎的臨 床價值。
[0007] HCAg是HCV復制的直接指標，在血液中含量少，為了研究HCV在宿主體內有無復制， 對他人有無傳染性，W及解決HCV感染的早期診斷，需要用特異性強、敏感度高的抗-HCV McAb建立敏感、特異和快速的血液中HCAg直接檢測試劑。由于丙型肝炎病毒的高度變異性， 人們在設計測定丙肝抗原的試劑盒時，自然地把注意力集中在病毒基因序列相對保守的結 構蛋白核屯、抗原。因此，目前商品化的試劑盒都是針對核屯、抗原，忽略了非結構蛋白NS3抗 原作為抗原祀點的可行性。國際上美國強生公司已推出了用雙抗體夾屯、法定性或定量檢測 血清樣品中總的或游離的HCV核屯、抗原化ISA試劑，雅培公司采用化學發光法定量檢測血清 或血漿樣品的HCV核屯、抗原化ISA試劑。但其試劑價格昂貴，不適合在國內普及應用。最近， 國外有報道:NS3抗原區域具有相對保守的抗原決定簇和較高的抗原性，是目前HCV抗體診 斷試劑盒的關鍵抗原。
【發明內容】
[0008] 有鑒于此，本發明旨在提供一種丙型肝炎病毒NS3抗原檢測試劑盒。
[0009] 為達到上述目的，本發明的技術方案是運樣實現的：一種丙型肝炎病毒NS3抗原檢 測試劑盒，包括如下主要成分:抗HCV-NS3單克隆抗體包被板、HCV-NS3校準品、樣品稀釋液、 濃縮的抗體酶結合物、濃縮的抗體酶結合物稀釋液、濃縮洗涂液、單組份TMB顯色液、終止 液、封板膜。
[0010] 進一步地，所述抗HCV-NS3單克隆抗體包被板為兩種抗HCV-NS3單克隆抗體包被的 酶標板。
[0011] 進一步地，所述濃縮的抗體酶結合物為第Ξ種抗HCV-NS3單克隆抗體與辣根過氧 化物的酶結合物。
[0012] 本發明還提供了上述丙型肝炎病毒NS3抗原檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于： 包括如下步驟：
[0013] (1)準備試劑盒和待測樣本，將濃縮洗涂液和濃縮的抗體酶結合物分別進行稀釋；
[0014] (2)加入準備好的待測樣本、HCV-NS3校準品和樣品稀釋液，輕輕震蕩均勻，封板， 37°C振蕩溫浴40min;
[0015] (3)洗板6次，拍干，加入稀釋后的濃縮的抗體酶結合物，封板，37°C振蕩溫浴 30min;
[0016] (4)洗板6次，拍干，加入單組份TMB顯色液，封板，37°C振蕩溫浴lOmin;
[0017] (5)加入終止液，lOmin內在酶標儀上ii定0D值；
[001引（6)處理數據。
[0019] 本發明還提供了上述試劑盒在檢測丙型肝炎病毒中的應用。
[0020] 相對于現有技術，本發明具有W下優勢：
[0021] (1)本發明應用純化HCV基因工程表達抗原HCAg對Ba化/c小鼠進行皮下多點免疫， 共免疫3次，小鼠產生抗體滴度高達1:25600,取得了良好的免疫效果，所獲的五株抗-HCV McAb只與HCV抗原蛋白產生反應，同皿V重組蛋白和大腸桿菌化-21菌體均無交叉反應，具有 良好的特異性。經鑒定，該抗體均屬IgGl型，K鏈。
[0022] (2)本發明制備的抗-HCV McAb具有W下特點：1)純化HCV基因工程表達抗原蛋白 效價高，純度好，為成功免疫動物和細胞融合打下了良好的基礎;2)所建立的5株單克隆雜 交瘤細胞株分泌的抗-HCV蛋白效價高，特異性良好，保存于液氮中多次復蘇傳代后仍能穩 定分泌抗體，用化ISA測定效價均未降低;3)所獲得的抗-HCV McAb同時含有抗HCV核屯、蛋白 和非結構蛋白NS3,為建立靈敏而有較寬檢測范圍的HCAg檢測試劑奠定了基礎。
[00剖 （3)本發明通過對242份肥V-NS3抗原陽性樣品的基因分型結果進行統計，化型178 份，占73.6%，2a型53份，占21.9%，3a型4份，占1.7%，3b型5份，占2.1 %，6a型2份，占 0.8%，說明本發明試劑盒可W覆蓋在我國流行的HCV主要基因型。
[0024] (4)本發明在對1245例臨床乙型肝炎患者血清樣本的檢測中，應用本發明試劑盒 測得HCV-NS3抗原陽性率為59 %，與HCV-RNA陽性重合率為80 %，與抗-HCV陽性重合率為 64%。
[0025] (5)本發明在對319名丙肝患者進行針對NS3的藥物（Simprevir)療效的對比研究 中，應用本發明試劑盒監測患者治療效果，結果發現;丙肝患者在接受針對NS3治療時，在監 測治療效果方面，本發明試劑盒顯示出較HCV-RNA檢測方法更高的靈敏度。
【具體實施方式】
[0026] 實施例一
[0027] 單克隆抗體的制備材料與方法
[002引 1.1材料
[0029] 純化HCV基因工程表達抗原HCAg，為中國預防醫學科學院病毒學研究所提供，NS3 抗原的氨基酸位置為175-423，蛋白質1.275g/L;
[0030] RPM1640和胎牛血清購自GibcoBRLP公司；
[0031] SP2/0骨髓瘤細胞由軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供；
[0032] Ba化/c小鼠購自軍事醫學科學院動物中屯、；
[0033] 單克隆抗體IgG亞類鑒定試劑為Sigma公司產品；
[0034] 抗-HCV ELISA檢測試劑盒由本所制備；
[0035] 抗-HCV McAb分片斷鑒定試劑為INN0GE肥TICS N.V.公司產品。
[0036] 1.2 方法
[0037] 1.2.1動物免疫
[0038] 取肥V重組抗原蛋白300mg/L與完全福氏佐劑等量混合制成乳化劑，共免疫Ba化/c 小鼠5只。第1次免疫l(K)yg/只，皮下多點注射，2周后用不完全福氏佐劑第2次免疫，劑量、途 徑與第1次相同。2周后尾靜脈取血測定效價，抗-HCV效價達1:1000~1:5000時供融合用。融 合前3d用抗原直接腹腔脾區加強免疫1次。
[0039] 采用常規間接化ISA法測定抗-HCV:包被聚苯乙締板的純化重組HCAg濃度為5mg/ L，酶標記抗體為羊抗鼠 IgG，工作濃度為1:5000，酶標儀450皿波長測定0D值。P/N值> 2.1倍 為陽性，< 2.1倍為陰性(N值<0.05，按0.05計算）。
[0040] 1.2.2細胞融合及克隆化和腹水制備
[0041] (1)免疫脾細胞的制備
[0042] 取已免疫Ba化/c小鼠，眼球放血供檢測抗體用。無菌操作取出脾臟，輕輕清洗并去 除結締組織，置于銅網上擠壓研磨，并通過網孔擠到溶液中，離屯、l〇〇〇r/min，5min，棄上清， 重懸于溶液中制成脾細胞懸液，加臺吩蘭染液作細胞計數。
[0043] (2)髓瘤細胞液制備
[0044] 將骨髓瘤細胞置于37°C5%C02培養箱中擴大培養。融合當天收集處于對數生長期 的SP2/0骨髓瘤細胞，離屯、lOOOr/min，5min，棄上清，重懸于液體后作細胞計數。
[0045] (3)細胞融合
[0046] 分別吸取脾細胞和骨髓瘤細胞懸液按5:1混合，置于離屯、管內充分混勻后離屯、，棄 上清，輕輕彈擊管底，使沉淀細胞松散均勻成糊狀。取50%的聚乙二醇(PEG)0.7mL加入混合 細胞中促進融合，嚴格控制作用時間在2~3min內，立即加入不完全培養液稀釋，使PEG中止 作用。離屯、80化/min，7min，棄上清。加入lOmL HAT培養液制成細胞懸液，并加入已鋪成飼養 細胞層的96孔板中，每孔0.1血，置37°C5%C02培養箱中培養，4~5d后換液1次，8~10加寸取 上清，用化ISA法測抗-HCV，進行初篩，陽性孔進行亞克隆。
[0047] (4)雜交瘤細胞的克隆化及腹水制備
[0048] 將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細胞用加樣器反復吹打均勻后，取少許細胞懸液 置另一無菌小瓶中。將此細胞懸液準確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細胞。將稀釋好 的細胞懸液接種于已鋪有飼養細胞層的96孔板中，每孔O.lmL，即每孔含一個細胞，置37°C 5%C02培養箱中培養，5d左右在倒置顯微鏡下觀察細胞克隆生長情況。反復克隆3次，確定 陽性單克隆細胞株，最后克隆株編號，置液氮中保存。取出部分陽性克隆株轉入24孔板，繼 而轉入培養瓶中進行擴大培養。將接種的雜交瘤細胞吹打下來，l〇(K)r/min離屯、lOmin，棄上 清，沉淀物用無血清培養液懸浮混勻，并將細胞調至（1~2) X106個/mL。選擇