一種檢測人尿中cd80的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種試劑盒，具體設及一種檢測人尿中CD80的試劑盒。
【背景技術】
[0002] CD80,又稱B7-1，是最早發現的共刺激分子，為I型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超 家族成員，W單體的形式表達于B細胞及其他抗原提呈細胞(APC)的表面。T細胞的活化、增 殖、分化繼而發揮其生物學效應至少需要雙重信號的參與。第一信號是人類主要組織相容 性復合體(MHC)/抗原膚/T細胞受體(TCR)復合物，第二信號是非抗原依賴的共刺激信號 (Immunol Today，1994，15: 321-331)。后者由T細胞膜上表達的配體CD28與APC膜上表達的 共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)相結合而完成。CD80(B7-1)和CD86(B7-2)在T細胞活 化中的作用有何不同尚無定論，CD86常低水平表達于B細胞、巨隧細胞W及樹突狀細胞的表 面，抗原刺激后表達迅速上調，而CD80則為誘導性表達，生理狀態下不表達或低表達，且抗 原刺激后表達上調速度慢，3-4天后表達才開始上調，因此CD86可能作用于免疫應答初期， 而CD80可能在免疫應答后期起一定的作用（Immunol Today，1999，20: 285-288; Curr Opin Cell Biol，1999，11:203-210;國際泌尿系統雜志，2013，33:282-285)。
[0003] 微小病變型腎病(Minimal Change Disease,MCD)是腎病綜合征的常見類型，目 前，其診斷依賴于腎臟活檢穿刺。MCD患者的尿中CD80的水平較其他腎小球疾病，包括局灶 節段性腎小球硬化(FSGS)、急性腎小球腎炎(AGN)、膜增生性腎小球腎炎(MPGN)、IgA腎病、 膜性腎病(MN)，W及系統性紅斑狼瘡腎炎和正常對照均顯著增高（J Am Soc Nephrol, 2009，20:260-266)。在MCD患者的腎臟活檢組織中發現CD80僅表達于足細胞化idney Int， 2010,78:296-302)。因此，人尿中CD80(B7-1)含量的檢測，可為腎臟病MCD的診斷和鑒別診 斷提供依據，有望改善腎活檢穿刺依賴的微小病變腎病的診斷現狀。
[0004] 通過國內專利檢索，人尿中CD80 (B7-1)的檢測尚無專利授權或申報。與CD80密切 相關的專利有:①抗人CD80雙價抗體及其應用:所述雙價抗體由重鏈可變區和輕鏈可變區 組成，其特征在于，兩者間由連接膚Gly4Ser相連，此發明所述雙價抗體與抗原的結合能力 強，對Raji細胞具有明顯的抑制作用，可W用于腫瘤成像中，也可W應用在制備抑制腫瘤細 胞增殖的藥物中。（申請號:CN201110056304;未授權;法律狀態:發明專利申請公布后的視 為撤回）；②免疫性疾病的診斷方法:包括用例如識別CD80抗原的抗人CD80單克隆抗體對分 離自人的體液中淋己細胞和/或淋己細胞亞群的CD80抗原陽性率進行免疫學測定的步驟。 其特征在于:可對各種免疫疾病進行簡便且準確的診斷，與W前的診斷方法相比，從患者中 可分離的外周血等體液中所含有的淋己細胞的操作簡便，患者的負擔小。而且還提供了含 有作為能減輕或預防免疫疾病的藥物的特異性識別CD80抗原的人抗CD80抗原抗體（申請 號:CN201380047212;未授權;法律狀態:公開）。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種新的靈敏度高、特 異性強的檢測人尿中CD80的試劑盒。
[0006] 為實現上述目的，所采取的技術方案:一種檢測人尿中CD80的試劑盒，所述試劑盒 包括包被有抗人CD80抗體的固相載體、酶標記的另一抗人CD80抗體、CD80標準品、樣品稀釋 液、洗涂液和發光底物液。
[0007] 優選地，所述人尿為晨尿。其中24小時尿液或口診隨機尿次之。
[0008] 優選地，所述固相載體是由聚苯乙締制成的不透明微孔板。更優選地所述固相載 體是黑色或白色微孔板。
[0009] 優選地，所述包被有抗人CD80抗體的固相載體是由W下方法制備而成的：
[0010] 將抗人CD80抗體按照比例（抗人CD80抗體:包被液=2~lOyg: ImL)的量加入至包 被液中，得到含有抗人CD80抗體的包被液，其中所述包被液為抑=9.6、0.05M的碳酸鹽;再 將所述含有抗人CD80抗體的包被液按10化L/孔加入至微孔板中，4°C放置24小時;去除包被 液后，按15化L/孔加入封閉液至微孔板中，37°C放置2~3小時，其中所述封閉液包括濃度為 O.Olmol/L、抑為7.2~7.4的口85(憐酸鹽緩沖液），1%(訊八）的牛血清白蛋白，0.05%(乂八） 的proclin300和5%(w/v)的薦糖;甩掉封閉液，拍干微孔板，室溫除濕干燥24~72小時，錫 錐紙封袋，置2~8Γ保存。
[0011] 優選地，所述酶標二抗是辣根過氧化物酶標記的二抗。所述二抗是與CD80結合的 檢測抗體。
[0012] 優選地，所述酶標二抗是由W下方法制備而成：
[0013] 用戊二醒偶聯法將二抗與辣根過氧化物酶偶聯，再用酶標抗體稀釋液稀釋至工作 濃度，其中酶標抗體稀釋液包括濃度為0.01~0. 〇5mol/L、pH為7.2~7.4的PBS，0.5% (w/v) 的牛血清白蛋白和0. l%(v/v)的proclinSOO。
[0014] 所述抗人CD80抗體和二抗，可W采用重組表達的人CD80免疫BALB/c小鼠，再經單 克隆篩選制備獲得，或用商品化人CD80抗體。
[0015] 優選地，所述CD80標準品為CD80重組蛋白。
[0016] 優選地，所述樣品稀釋液包括濃度為0.01~0.2mol/L、pH為5.7~7.0的PBS。
[0017] 優選地，所述洗涂液包括濃度為0.01~0.2mol/L、pH為7.2~7.4的PBS，和體積濃 度為0.01%~0.05%(v/v)的TritonX-100。
[0018] 優選地，所述發光底物液包括發光底物A液和發光底物B液，所述發光底物A液包括 魯米諾和異魯米諾中的至少一種W及發光增強劑，所述發光底物B液包括過氧化氨和過氧 化脈中的至少一種W及穩定劑。優選地，所述發光底物A液和發光底物B液的體積比為1:1。
[0019] 本發明試劑盒的使用方法如下：
[0020] (1)試劑盒保存于2~8°C冰箱，使用前先將試劑盒平衡至室溫，平衡時間不少于30 分鐘；
[0021] (2)將10化1待檢的尿液標本和CD80系列標準品分別加入微孔板的不同板孔中，于 37 °C反應30分鐘；
[0022] (3)用洗涂液洗涂板孔2~3次，每次靜置3~5分鐘，最后棄去洗涂液；
[0023] (4)將10化1辣根過氧化物酶標記的二抗加入步驟(3)洗涂后的板孔中，于37°C反 應30分鐘；
[0024] (5)用洗涂液洗涂板孔2~3次，每次靜置3~5分鐘，最后棄去洗涂液；
[0025] (6)將發光底物A液和B液按1:1的體積混勻后，加入步驟(5)洗涂后的板孔中，再將 微孔板放入化學發光檢測儀中，檢測發光值；
[0026] (7)根據發光值與CD80標準品的濃度關系計算待檢測的尿液中CD80的含量。
[0027] 本發明的有益效果在于:本發明的優點在于建立了一種僅適用于尿液中微量CD80 的靈敏、特異的定量檢測試劑盒，不受尿液中其他成分的干擾。本發明試劑盒基于固相酶促 化學發光法，W包被抗人CD80抗體的微孔板為固相載體，用辣根過氧化物酶為催化酶催化 發光底物發光，顯著提高了試劑的檢測靈敏度。本發明為微小病變腎病的鑒別診斷提供了 一種檢測手段，有助于改善腎活檢穿刺依賴的微小病變腎病的診斷現狀。
【附圖說明】
[0028] 圖1為采用本發明所述試劑盒檢測微小病變腎病(MCD)患者、局灶節段性腎小球硬 化(FSGS)患者和狼瘡腎炎患者尿液標本中CD80的含量結果。
【具體實施方式】
[0029] 為更好地說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明 作進一步說明。
[0030] 實施例1
[0031] 一、檢測人尿中CD80的試劑盒的制備
[0032] 1、抗人CD80抗體的固相載體的制備：
[0033] 將抗人CD80抗體按照比例（抗人CD80抗體:包被液=化g: ImL)的量加入至包被液 中，得到含有抗人CD80抗體的包被液，其中所述包被液為抑=9.6、0.05M的碳酸鹽;再將所 述含有抗人CD80抗體的包被液按10化17孔加入至微孔板中，4°C放置24小時；去除包被液 后，按150μLν孔加入封閉液至微孔板中，37°C放置3小時，其中所述封閉液包括濃度為 O.Olmol/L、抑為 7.2 的 PBS，l%(w/v)的牛血清白蛋白，0.05%(v/v)的 proclin300 和 5%(w/ V)的薦糖;甩掉封閉液，拍干微孔板，室溫除濕干燥24小時，錫錐紙封袋，置2~8°C保存。
[0034] 2、酶標二抗的制備：
[0035] 用戊二醒偶聯法將二抗與辣根過氧化物酶偶聯，再用酶標抗體稀釋液稀釋至工作 濃度，其中酶標抗體稀釋液包括濃度為0.0 lmol/L、抑為7.2的PBS，0.5% (w/v)的牛血清白 蛋白