三孢布拉氏霉菌代謝組的樣品前處理及樣本檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及代謝組學的技術領域，具體說是一種Ξ抱布拉氏霉菌代謝組的樣品前 處理及樣本檢測方法。
【背景技術】
[0002] 隨著人類基因組測序工作完成，基因功能的研究成為熱點，各種"組學"相繼出現， 代謝組學繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后應運而生。代謝物組學的研究對象是生 物體內整體代謝物的變化，為了更加全面、系統地了解運種變化，代謝物分析方法應依據代 謝物物理化學參數的差異，采用不同的分析方法，力求滿足高選擇性、高靈敏度、高通量、多 維、動態、多參量的特點。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決的技術問題是提供一種Ξ抱布拉氏霉菌代謝組的樣品前處理及樣 本檢測方法。
[0004] 本發明為解決公知技術中存在的技術問題所采取的技術方案是： 本發明的Ξ抱布拉氏霉菌代謝組的樣品前處理方法，包括W下步驟： (1) 培養Ξ抱布拉氏霉菌： 曰、種子培養:將Ξ抱布拉氏霉正負菌分別活化后轉接到500mL^角瓶中，培養基裝液量 lOOmL，培養溫度為27 °C，搖床轉速220巧m，培養時間為48-5化； 種子培養基按質量百分比組包括：玉米淀粉3.5%、黃豆餅粉2.3%、KH2P04 0.15%、 MgS04'7肥0 0.01%、工業玉米漿1%、豆油0.5%，其余為水； b、發酵培養:將上述正負菌種子液按比例接種到發酵培養基，發酵生產β-胡蘿h素；向 發酵過程中流加混菌發酵液； 發酵培養基中按質量百分比包括:玉米淀粉3.0%、黃豆餅粉2.0%、Κ也P〇4 0.25%、MgS〇4 · 7出0 0.02%、豆油3.0%、工業玉米漿2.0%、維生素 B1 0.005%、巧樣酸Ξ鋼0.3%、曲拉通 0.1%、ΒΗΤ 0.05%、混菌發酵液10%，其余為水； (2) 樣品制備： 分別取12h、48h、72h的樣品進行代謝樣品制備； A:利用不同提取液對相同樣品進行提取，提取劑為:-40°C預冷的60% v/v乙醇水、2: 2:lv/v的氯仿：乙醇：水、60% v/v沸乙醇、60% v/v冷甲醇； B:樣品衍生化 .友取200化提取液加10化的1 mg/mL 丫-氨基下酸，真空冷凍干燥后，加50化濃度 為20 mg/mL的甲氧基錠鹽酸鹽/化晚溶液，充分溶解樣品，置于40°C水浴中，反應80 min; 雪加80化N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺，混合均勻，置于40° C水浴中，反應80 mi打； 霉將衍生后的樣品10 000 r/min離必5 min;取上清液100化加入進樣瓶中，并編號， 于室溫放置2 h。
[0005] 本發明的Ξ抱布拉氏霉菌代謝組樣品的檢測方法，對樣品進行GC-MS檢測； GC條件:Agi len地P530m X 0.25mm X 0.25皿毛細管柱;進樣口溫度:280° C;升溫程序:初 始溫度70° C保持2 min，W5° C/min程序升溫至290° C保持5 min;載氣:高純氮氣，恒壓模式 91 kPa;進樣量1 柱后分流比10:1; MS條件:接口溫度:280 C;電罔方式:EI;電罔方式：電子轟擊電罔（EI+);罔子源溫度： 250°。電子轟擊能量:70 eV;電子電流:40 μΑ;掃描質量范圍：50-800 m/z。
[0006] 本發明具有的優點和積極效果是： 本發明的Ξ抱布拉氏霉菌代謝組的樣品前處理及樣本檢測方法中，利用PDA培養基培 養Ξ抱布拉氏霉菌，培養4d后收集菌絲，液氮滅活后超低溫冰箱保存備用;冷凍研磨破碎菌 絲樣品，代謝組提取采用冷凍過的甲醇水混合物W使酶失活;真空冷凍干燥后，經過朽化或 腺化、硅烷化兩步衍生化反應后用于GC-MS檢測。本發明還提供了利用GC-MS對上述樣品 的檢測方法，檢測條件如下：選用Agi len地P530m X 0.25mm X 0.25WI1毛細管柱;進樣量化L ;程序升溫；離子源溫度250°C，全掃描范圍m/z50~800。采用本發明能得到重現性較好 的代謝組檢測結果。
【附圖說明】
[0007] 圖1是采用-40°C預冷的60%v/v乙醇水作為提取劑時的GC-MS TIC總離子流圖； 圖2是采用2:2: Iv/v的氯仿：乙醇:水溶液作為提取劑時的GC-MS TIC總離子流圖； 圖3是采用60% v/v沸乙醇作為提取劑時的GC-MS TIC總離子流圖； 圖4是采用60% v/v冷甲醇作為提取劑時的GC-MS TIC總離子流圖。
【具體實施方式】
[0008] W下通過附圖和具體實施例對本發明中的技術方案進行詳細說明： 實施例1: 本發明的Ξ抱布拉氏霉菌代謝組的樣品前處理方法，包括W下步驟： (1) 培養Ξ抱布拉氏霉菌： 曰、種子培養:將Ξ抱布拉氏霉正負菌分別活化后轉接到500mL^角瓶中，培養基裝液量 lOOmL，培養溫度為27 °C，搖床轉速220巧m，培養時間為4她； 種子培養基按質量百分比組包括：玉米淀粉3.5%、黃豆餅粉2.3%、KH2P04 0.15%、 MgS04'7肥0 0.01%、工業玉米漿1%、豆油0.5%，其余為水； b、發酵培養:將上述正負菌種子液按比例接種到發酵培養基，發酵生產β-胡蘿h素；向 發酵過程中流加混菌發酵液； 發酵培養基中按質量百分比包括:玉米淀粉3.0%、黃豆餅粉2.0%、Κ此Κ)4 0.25%、MgS化· 7出0 0.02%、豆油3.0%、工業玉米漿2.0%、維生素 B1 0.005%、巧樣酸Ξ鋼0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、混菌發酵液10%，其余為水； (2) 樣品制備： 分別取12h、48h、72h的樣品進行代謝樣品制備； A:利用不同提取液對相同樣品進行提取，提取劑為:-40°C預冷的60% v/v乙醇水； B:樣品衍生化 是取200化提取液加10化的1 mg/mL 丫-氨基下酸，真空冷凍干燥后，加50化濃度 為20 mg/mL的甲氧基錠鹽酸鹽/化晚溶液，充分溶解樣品，置于40°C水浴中，反應80 min; 惡加80化N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺，混合均勻，置于40° C水浴中，反應80 mi打； ;霉;將衍生后的樣品10 000 r/min離必5 min;取上清液100化加入進樣瓶中，并編號， 于室溫放置2 h。
[0009]本發明的Ξ抱布拉氏霉菌代謝組樣品的檢測方法，對樣品進行GC-MS檢測； GC條件:Agi len地P530m X 0.25mm X 0.25皿毛細管柱;進樣口溫度:280° C;升溫程序:初 始溫度70° C保持2 min，C/min程序升溫至290° C保持5 min;載氣:高純氮氣，恒壓模式 91 kPa;進樣量1 柱后分流比10:1; MS條件:接口溫度:280° C;電離方式:EI;電離方式：電子轟擊電離(EI+);離子源溫度： 250°。電子轟擊能量:70 eV;電子電流:40 μΑ;掃描質量范圍：50-800 m/z。
[0010] 所得GC-MS TIC總離子流圖如圖1所示。
[0011] 實施例2: 本發明的Ξ抱布拉氏霉菌代謝組的樣品前處理方法，包括W下步驟： (1) 培養Ξ抱布拉氏霉菌： 曰、種子培養:將Ξ抱布拉氏霉正負菌分別活化后轉接到500mL^角瓶中，培養基裝液量 lOOmL，培養溫度為27 °C，搖床轉速22化pm，培養時間為52h; 種子培養基按質量百分比組包括：玉米淀粉3.5%、黃豆餅粉2.3%、KH2P04 0.15%、 MgS04'7肥0 0.01%、工業玉米漿1%、豆油0.5%，其余為水； b、發酵培養:將上述正負菌種子液按比例接種到發酵培養基，發酵生產β-胡蘿h素；向 發酵過程中流加混菌發酵液； 發酵培養基中按質量百分比包括:玉米淀粉3.0%、黃豆餅粉2.0%、Κ此Κ)4 0.25%、MgS化· 7出0 0.02%、豆油3.0%、工業玉米漿2.0%、維生素 B1 0.005%、巧樣酸Ξ鋼0.3%、曲拉通 0.1%、BHT 0.05%、混菌發酵液10%，其余為水； (2) 樣品制備： 分別取12h、48h、72h的樣品進行代謝樣品制備； A:利用不同提取液對相同樣品進行提取，提取劑為:2:2:1 v/v的氯仿：乙醇:水； B:樣品衍生化 憑取200化提取液加10化的1 mg/mL 丫-氨基下酸，真空冷凍干燥后，加50化濃度 為20 mg/mL的甲氧基錠鹽酸鹽/化晚溶液，充分溶解樣品，置于40°C水浴中，反應80 min; 惡加80化N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺，混合均勻，置于40° C水浴中，反應80 min； 2將衍生后的樣品10 000 r/min離屯、5 min;取上清液100化加入進樣瓶中，并編號， 于室溫放置2 h。
[0012] 本發明的Ξ抱布拉氏霉菌代謝組樣品的檢測方法，對樣品進行GC-MS檢測； GC條件:Agi len地P530m X 0.25mm X 0.25皿毛細管柱;進樣口溫度:280° C;升溫程序:初 始溫度70° C保持2 min，W5° C/min程序升溫至290° C保持5 min;載氣:高純氮氣，恒壓模式 91 kPa;進樣量1 柱后分流比10:1; MS條件:接口溫度:280 C;電罔方式:EI;電罔方式：電子轟擊電罔（EI+);罔子源溫度： 250°。電子轟擊能量:70 eV;電子電流:40 μΑ;掃描質量范圍：50-800 m/z。
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