的生物電化學檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種維生素 B2的生物電化學檢測方法，屬于生化檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 維生素 B2，VB2,即核黃素，化學式為Cn也0機〇6。它是一種水溶性B族維生素，在機體 的碳水化合物、蛋白質及脂肪的能量轉化過程中起著重要作用，對人類健康有著重要意義。
[0003] VB2缺乏會引起人體代謝障礙，從而引發多種病變。其病變多表現為口、眼和外生 殖器部位的炎癥，如口角炎、唇炎、舌炎、眼結膜炎和陰囊炎等。值得注意的是，人體自身不 能合成VB2,只能通過膳食中獲取。因此，VB2含量是評估食品營養及其功能性的重要指標。同 時，由于^2缺乏是一種常見病癥，所WVB2成為相關藥品及保健品的重要成分，其含量也常 被作為運類商品的重要質量指標。綜上，VB2含量的快速、準確測定在VB2的合成及其相關的 食品、藥品及保健品行業生產中有重要意義。
[0004] 現有的VB2檢測方法包括微生物法、巧光分光光度法、高效液相色譜法(冊LC)、W 及質譜法。
[0005] 微生物法是國標法中常采用的一種檢測VB2方法，其原理即某一種微生物的生長 (繁殖)必需某些維生素，在一定條件下，該細菌的生長情況及代謝產物與該維生素的含量 成正比，W此來測定某一維生素的含量。王光亞在《食物中核黃素測定方法的比較》一文中 (生理科學，1988，8:419-420)指出微生物法其特異性和靈敏度較高，但是方法費時，周期 較長，給實際測定過程帶來不便。
[0006] 巧光分光光度法是目前應用較廣泛的一種VB2檢測方法。該方法利用VB2在pH 4~ 9、440~500皿激發光照射下產生黃綠色巧光的特性，根據巧光強度與濃度成正比的 原理對VB2進行定量測定。宋吉英在《巧光分光光度法測定構杞中核黃素含量》一文中（化學 世界，2012，12: 720-722)報道了使用巧光分光光度法測定了構杞中的VB2的研究方法。該 方法簡便、快速，但由于食物中的巧光雜質較多，干擾測定，該方法僅適用于含乂恥較高干擾 較少的乳類，故局限了其應用發展。
[0007] HPLC測定方法是根據樣品中各種物質在色譜柱中分離系數的不同，將其同樣品中 干擾物分開，并根據目標檢測物的分子特性選擇對應的檢測器進行定性定量檢測。VB2的測 定通常采用巧光檢測器，C18色譜柱，激發波長440nm，發射波長在525nm左右。鄧潔熊等人在 《HPLC測定核黃素憐酸鋼中核黃素的含量》文章中（廣東藥學院學報，2006，2(1):53-54) 報道了核黃素憐酸鋼中VB2含量的HPLC測定方法。該方法相對簡單、快速、重復性好，但是對 儀器有較高要求，樣品處理較為繁瑣。
[000引質譜法是純物質鑒定的最有力工具之一，利用電場和磁場將運動的離子，按它們 的質荷比分離后進行檢測的方法。Mandal等人在《Rapid determination of vitamin B2 and Bi2 in human urine by isocratic liquid chromatography》一文中（Analytica 化imica Acta, 2009, 640: 110-113)報道了分別利用高效液相色譜法和基質輔助激光解 吸電離質譜法測定人類尿液中的VB2含量。然而在進行有機物定量分析時要經過一系列分 離純化操作，十分麻煩，并且質譜儀屬于大型昂貴儀器，檢測成本高。
[0009] 生物電化學傳感器則是指由生物材料作為敏感元件，電極(固體電極、離子選擇性 電極、氣敏電極等)作為轉換元件，W電勢或電流為特征檢測信號的傳感器。由于使用生物 材料作為傳感器的敏感元件，所W電化學生物傳感器具有高度選擇性，是快速、直接獲取復 雜體系組成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技術、食品工業、臨床檢測、醫藥 工業、生物醫學、環境分析等領域獲得實際應用。
[0010] 在特定電位控制條件下，希瓦氏菌可W在自身的富馬酸還原酶（Selenite reduction by Shewanella oneidensis Μ民-1 is mediated by fumarate reductase in periplasm,SCIENTI門C 肥PORTS,2014,4:3725，D01:10.1038/srep03735)的催化作用下， 利用來源于胞外電極的電子還原富馬酸，并在外電路形成電流。而VB2是希瓦氏菌實現該細 胞內外電子轉移過程的電子中介體，其濃度高低與該過程的電子轉移效率即外電路電流強 度大小直接相關。因此，可W直接通過反應體系的電流變化來高效、快速檢測樣品中得VB2 并測定其濃度，本發明基于此構建了一種新型的VB2生物電化學檢測方法，經過對現有技術 的檢索，并未發現有利用生物電化學方法檢測VB2的報道。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的在于提供一種新的專一性測定VB2的方法，解決現有技術中存在的 檢測成本高、檢測儀器昂貴、數據重復性差、操作過程(包括制備樣品及樣品預處理等過程） 復雜的問題。
[0012] 本發明的技術方案是： 一種維生素 B2的生物電化學檢測方法，按W下步驟進行操作： (1) 將希瓦氏菌種接種至LB液體培養基進行培養，活化菌體； (2) 將活化的希瓦氏菌菌液離屯、，按一定比例將離屯、后的沉淀加入到反應緩沖溶液 中； (3) 將參比電極、工作電極、對電極安裝在含有步驟(2)得到的溶液的裝置中，連接信 號檢測系統，組成生物電化學傳感器； (4) 在步驟(3)得到的生物電化學傳感器的工作電極上加載外電壓，待電流輸出穩定 后，向系統中加入希瓦氏菌的電子受體； (5) 待電流輸出穩定，向Ξ電極系統中加入VB2樣品，檢測并記錄電流變化值。
[OOU] 其中希瓦氏菌（Siewanella oneidensis),購自美國模式菌種保藏中屯、(ATCC);將 保存的希瓦氏菌接種至培養基進行培養，獲得活化的菌體。
[0014] 其中反應緩沖液（參考：A whole-cell electrochemical biosensing system based on bacterial inward electron flow for fumarate quantification. Rong- WeiSi, Dan-DanZhai, Zhi-HongLiao, LuGao , Yang-ChunYong. Biosensors andBioelectronics68(2015)34-40)由W下物質組成，LB液體培養基：膜蛋白腺10 g/L、酵 母提取物5g/L、氯化鋼5 g/L pH=7;M9培養基:化抽P04.12出0 17.8 g L-i、K出P〇4 3g [1、 NaCl 0.5 g L-i、NH4C1 10.5 g L-i、18mM乳酸鋼、0.1 ml的CaCl2和 1 mM的MgS04。
[0015] 其中，步驟(2)中所述的希瓦氏菌沉淀加入到反應緩沖溶液中，其OD值控制在1.5- 2之間； 步驟(3)中參比電極為飽和甘隸電極或銀/氯化銀電極;工作電極為碳拉或 碳布;對電極為銷絲電極； 步驟(3)中所述的信號檢測系統由記錄電流輸出的儀器和控制電位的儀器組成，如電 化學工作站CHI 660E(上海辰華儀器有限公司）； 步驟(4)中所述希瓦氏菌的電子受體為富馬酸溶液、亞硝酸溶液、亞硫酸鹽溶液、硝酸 鹽溶液、二甲基亞諷、硫代硫酸鹽溶液或氧化Ξ甲胺溶液;進一步優選為富馬酸溶液，加入 富馬酸溶液濃度為5mM~飽和濃度。
[0016] 步驟(4)中所述的生物電化學傳感器所加載的外電壓為-1.5~0伏特。
[0017] 本發明還提供一種檢測VB2的生物電化學傳感器，所述的傳感器包括信號檢測系 統，電極系統和信號發生系統，其中所述的VB2信號發生系統包括希瓦氏菌的電子受體、希 瓦氏菌菌液和反應緩沖溶液； 其中所述希瓦氏菌的電子受體為富馬酸溶液、亞硝酸溶液、亞硫酸鹽溶液、硝酸鹽溶 液、二甲基亞諷、硫代硫酸鹽溶液或氧化Ξ甲胺溶液，優選為富馬酸溶液。
[001引本發明的有益效果： 本發明使用了簡單的電化學儀器來實現電壓控制和電流信號記錄，所W檢測的成本低 廉；由于VB2形成的電流響應是和電化學反應轉移的電子數直接相關的，因此根據電流響應 設備的精確度能夠達到高的靈敏度、穩定性和重復性（當同時制備Ξ個及W上的生物電化 學傳感器時，加入同樣濃度的VB2樣品，并使用同樣的電流信號記錄儀記錄電流響應時，檢 測結果高度一致，變異系數小于9%);且該發明對于核黃素檢測具有很強的專一性，當向反 應體系添加多種維生素及常見陽離子干擾物時，無明顯電流變化。
[0019] 按照上述實驗所使用的裝置，測得VB2檢測的濃度線性范圍為5 nM到10 μΜ，定性 檢測下限為InM。相比HPLC檢測法和巧光分光光度計法等具有更寬的測量范圍，可用于生化 檢測、食品檢測中VB2的測定。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明的生物電化學傳感器示意圖； 圖2添加不同濃度VB2標準溶液后的電流輸出信號結果； 圖3為本發明所提供的VB2檢測方法測得的標準曲線； 圖4當VB2濃度為5nM和lOyM時的電流輸出信號結果； 圖5 W碳拉為陽極材料時的電流輸出信號結果； 圖6當外加電壓為0伏特、-0.2伏特、-0.4伏特和-1.5伏特時的電流輸出信號