一種氫化可的松生物催化轉化率的快速檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物轉化制藥中藥物產量的檢驗分析領域，設及一種氨化可的松生物 催化轉化率的快速檢測方法，適用于藥物的生物轉化工藝過程研究和檢測。
【背景技術】
[0002] 氨化可的松是一種腎上腺皮質激素類藥物，在臨床上應用廣泛。同時它還是生產 潑尼松等其他類高效皮質激素藥物的基礎原料。
[0003] 肥的生產是W化合物RS(17-^基孕醬-4-締-3,20-二酬)或化合物354(17-徑基孕 醬-4-締-3,20-二酬-21-醋酸醋)為底物經過微生物的ΙΙβ-徑基化反應得到。微生物菌種對 HC的轉化率和收率影響很大，因此選育高產氨化可的松的優良菌種一直是工業上的研究目 標。
[0004] 工業上選育高產氨化可的松的優良菌種，一般是采用誘變育種方式。誘變育種過 程中，經誘變產生高產菌株的頻率很低，因此都需要從龐大的菌種庫中檢出目標菌種。氨化 可的松轉化率的檢測，一般是首先用有機溶劑將搖瓶發酵的發酵液成分萃取出來，再通過 薄層層析法，對HC的產量作定性檢測。最終通過高效液相色譜法，確定菌種對氨化可的松的 轉化率。
[0005] 薄膜層析法和液相色譜法是目前國內絕大多數工廠檢測都在使用的方法。薄膜層 析法，存在取樣量大，萃取劑易揮發，操作繁瑣，定量不準確，易受環境干擾等問題；另有液 相色譜法測定結果準確，但檢驗時間過長，程序復雜，儀器價格昂貴，均不適于生產現場快 速檢驗的要求。因此，運些點已遠遠不能滿足現代檢測，W及高通量篩選高轉化率菌種的要 求。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種精度和靈敏度都高的氨化 可的松生物催化轉化率的快速檢測方法。
[0007] 本發明實現目的的技術方案是：
[000引一種氨化可的松生物催化轉化率的快速檢測方法，步驟如下：
[0009] (1)利用主產物氨化可的松、副產物表氨化可的松、底物17-徑基孕醬-4-締-3,20- 二酬-21-醋酸醋遇濃硫酸反應顯不同顏色的特性，使用乙酸乙醋將發酵液中成分萃取出 來，加入濃硫酸，使其與硫酸發生反應，導致顏色發生相應變化；
[0010]間先對HC/濃硫酸、EHC/濃硫酸、RSA/濃硫酸進行全波長掃描，得到HC/濃硫酸、 RSA/濃硫酸的最大吸收峰值分別為474nm、535nm;
[0011] 間根據朗伯比爾定律結合Ξ維數據建模二階校正得出氨化可的松轉化率的計算 公式；
[0012] (4)通過測定發酵液中的成分與濃硫酸反應在可見光雙波長下的0D值，即可計算出 待測發酵液中氨化可的松的轉化率。
[oou] 而且，具體步驟如下：
[0014] (1)待測菌種發酵產生的發酵液降至3.8W下后，調節pH為6.5,投入0.25%的RSA， 繼續培養至72h;
[0015] 間將步驟(1)得到的發酵液中加入等量的乙酸乙醋，充分萃取后取化L上層有機相 置于96孔石英酶標板中；
[0016] 間待步驟間中96孔石英酶標板中的乙酸乙醋揮發后，加入200化濃硫酸，反應 15min后使用酶標儀檢測其在474nm處和535nm處的0D值；
[0017] (4)將氨化可的松、表氨化可的松、RSA、RS的標準品加無水乙醇溶解后，分別配置成 濃度為〇.5mg/mL的膽備液；
[001引巧)將步驟(4備到的HC、RSA、EHC，按照HC不同轉化率，保持總質量為0.025mg，添加 不同體積配比的RSA、肥、E肥標準品溶液于96孔石英酶標板中，待無水乙醇揮發后，加入200 化的濃硫酸，反應15min，分別在474nm、535nm波長處測定吸光度；
[0019] (6)將步驟間測得不同HC轉化率對應474nm和535nm處的0D值整理，根據(A474nm- A53日皿)/A474皿計算出當X = 0.6時的數值Κο;再通過singmapolt軟件擬合成^維立體平面圖， 并由此得出轉化率X與A474皿、A日3日皿之間的函數關系；
[0020] 例將步驟間中待測試樣在474nm、535nm處的0D值代入公式K=(A474nm-A日3日nm)/ A474?，很據計算出的K值，將轉化率在0-0.6之間的與0.6-1之間的分開，再步驟做得到的轉 化率X與A474皿、A日3日皿之間的函數關系，即可計算出待測發酵液中HC的轉化率，進而快速檢測 出發酵液中HC的含量。
[0021 ] 而且，所述的步驟(1)中投料RSA要用80 %的工業酒精助溶。
[0022]而且，所述的步驟間中發酵液和等量的乙酸乙醋濃硫酸要充分萃取，再室溫下靜 置一段時間。
[0023 ] 而且，所述的步驟間中標品與濃硫酸反應的時間準確控制在15min。
[0024] 本發明的優點和積極效果是：
[0025] 1、本發明操作簡單快捷，測試時間短、試樣用量小，容易實現并行操作，精確性高。 重復性誤差在10 % W內；可檢出氨化可的松的轉化率在10 % -95 %之間，檢測方法操作簡單 快捷，單個樣品的測試時間在20min之內，而薄層層析法及高效液相色譜法所需時間較長。
[0026] 2、本發明提出的方法能快速檢測發酵液中HC的轉化率，極大的提高菌種篩選效 率，為高通量篩選高效菌株，提高醬體藥物氨化可的松的轉化效率提供了可靠的保證。
[0027] 3、本發明提供的檢測方法檢測試樣用量小，容易實現并行操作;檢測方法的精確 性高，幾乎不受環境條件影響，重復性誤差在5% W內。精度和靈敏度均高于薄層層析法。
[0028] 4、本發明提供的檢測方法適用于高產氨化可的松的菌株的高通量篩選，克服了傳 統篩選優良菌種方法中操作困難、篩選工作量大且效率低下的缺點，大大縮短了篩選周期， 提高了工作效率。
【附圖說明】
[0029] 圖1是氨化可的松轉化率小于60%的Ξ維雙波長吸光度數據圖；
[0030] 圖2是氨化可的松轉化率大于60%的Ξ維雙波長吸光度數據圖；
[0031] 圖3是1號菌株發酵液成分的HPLC檢測結果；
[0032] 圖4是2號菌株發酵液成分的HPLC檢測結果；
[0033] 圖5是3號菌株發酵液成分的HPLC檢測結果。
【具體實施方式】
[0034] 下面通過具體的實施方案敘述本發明方法。除非特別說明，本發明中所用的技術 手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發 明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背 離本發明實質和范圍的前提下，對運些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改 動也屬于本發明的保護范圍。
[0035] 本發明公開了一種氨化可的松生物催化轉化率的快速檢測方法，利用主產物氨化 可的松化C)、副產物表氨化可的松化HC)、底物17-徑基孕醬-4-締-3,20-二酬-21-醋酸醋 (RSA)遇濃硫酸反應顯不同顏色的特性，使用乙酸乙醋將發酵液中成分萃取出來，W適當的 比例加入濃硫酸，使其與硫酸發生反應，導致顏色發生相應變化。先對HC/濃硫酸、E肥/濃硫 酸、RSA/濃硫酸進行全波長掃描，得到HC/濃硫酸、RSA/濃硫酸的最大吸收峰值分別為 474nm、535nm;再根據朗伯比爾定律結合Ξ維數據建模二階校正得出肥轉化率的計算公式。
[0036] 實驗結果表明：采用可見光雙波長檢測法，根據朗伯比爾定律結合Ξ維數據建模， 通過測定發酵液中的成分與濃硫酸反應在可見光雙波長下的0D值，即可計算粗略出待測發 酵液中HC的轉化率。
[0037] 具體的氨化可的松的轉化率的快速檢測方法，其特征在于:所述方法包括W下步 驟：
[003引（：L値株斜面用無菌水制成抱子懸液，取ImL接種于盛有30mL種子培養基的250mLS 角瓶中，28°C、180r/min搖床振蕩培養20h。
[0039] 間將步驟過)中得到的種子培養液，接種于盛有50mL發酵培養基的500mLS角瓶中， 搖床振蕩培養。
[0040] 間檢測步驟間中的發酵液降至3.8 W下后，調節pH為6.5，投入0.25 %的RSA，繼續 培養至7化。
[0041] (4)將步驟間得到的發酵液中加入等量的乙酸乙醋。充分萃取后取化L上層有機相 置于96孔石英酶標板中。
[0042] 間待步驟(4)中96孔石英酶標板中的乙酸乙醋揮發后，加入200化濃硫酸，反應 15min后使用酶標儀檢測其在474nm處和535nm處的0D值。
[0043] 做將氨化可的松、表氨化可的松、RSA、RS的標準品加無水乙醇溶解后，分別配置成 濃度為〇.5mg/mL的膽備液。
[0044] 例將步驟做得到的HC、RSA、EHC，按照HC不同轉化率，保持總質量為0.025mg，添加 不同體積配比的RSA、肥、E肥標準品溶液于96孔石英酶標板中，待無水乙醇揮發后，加入200 化的濃硫酸，反應15min，分別在474nm、535nm波長處測定吸光度。
[0045] 設)將步驟例測得不同HC轉化率對應474nm和535nm處的0D值整理，根據（A474nm- A53日皿)/A474皿計算出當X = 0.6時的數值Κο;再通過singmapolt軟件擬合成^維立體平面圖， 并由此得出轉化率X與A474皿、A日3日皿之間的函數關系。
[0046] (9)將步驟間中待測試樣在474nm、535nm處的0D值代入公式K=(A474nm-A日3日nm)/ A474n"，很據計算出的Κ值，將轉化率在0-0.6之間的與0.6-1之間的分開，再步驟腳得到的轉 化率X與Α474皿、A日3日皿之間的函