冬油菜葉片質外體抗凍蛋白標樣制備方法及蛋白裂解液的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于蛋白質組學技術領域，涉及一種冬油菜葉片質外體抗凍蛋白標樣制備方法;本發明還涉及一種該制備方法所用的蛋白裂解液。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著我國冬油菜北移和北方冬油菜新產區的逐步形成，白菜型冬油菜成為了北方地區重要的油料作物和生態作物，同時也是促進北方耕作制度改革的先驅作物(孫萬倉，馬衛國，雷建民，等.冬油菜在西北旱寒區的適應性和北移的可行性研究[J].中國農業科學，2007，40(12): 2716-2726)。由于我國北方地區冬季旱寒等嚴酷的氣候，嚴重影響冬油菜的生長發育，使得抗寒性一般的冬油菜越冬困難，因此研究冬油菜的抗寒性具有重要意義。徐呈祥等對豐富多樣的低溫誘導蛋白質進行研究，發現其中的抗凍蛋白在植物抗寒冷機制中有著十分重要的作用(提高植物抗寒性的機理研究進展[J].生態學報，2012，32(24): 7966-7980.)。抗凍蛋白(Antifreeze Protein，AFP)是一類可以吸附到冰晶表面抑制冰晶生長速度、修飾冰晶形態、降低溶液冰點、抑制冰晶重結晶的蛋白質，對研究植物抗寒有重大意義。Griffith等在1992年第一次明確提出獲得植物內生的抗凍蛋白，他們從經低溫鍛煉能夠忍受細胞外結冰的冬黑麥中發現了內源產生的AFP，并從冬黑麥葉片的質外體中提取并部分純化了該蛋白；1994年費云標等從常綠抗凍植物沙冬青葉片中分離得到了抗凍蛋白；Meyer等在1999年發現胡蘿卜AFP基因在非低溫脅迫下不表達，在低溫脅迫下表達水平迅速提高。
[0003]SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺)凝膠電泳是分析生物體蛋白質常用的方法，其技術多采用Laemmli(1970)分析細菌蛋白的方法，該方法通過利用蛋白質具有分子量大小不同的特性分離不同的蛋白質，分離效果顯著。之后隨著二維電泳的逐漸發展，雙向電泳成為了蛋白質組研究領域中的關鍵技術之一。但無論是SDS-PAGE凝膠電泳還是雙向電泳，樣品的制備都是其中關鍵的一步，在樣品制備過程中應遵循三個基本原則:I)盡可能的提尚樣品蛋白的溶解度，減少蛋白質的損失;2)減少對蛋白質的人為修飾;3)破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用，使蛋白質處于完全變性狀態。由于提取的植物材料不同，使用的蛋白裂解緩沖液也各不相同，需要通過不同試劑的合理組合，才能達到對樣品蛋白的最大提取。在提取過程中通過使用一些輔助增溶藥劑來提高蛋白質的溶解性，特別是膜蛋白和疏水蛋白，其中尿素是較理想的中性增溶劑，它能很好地提高蛋白質的溶解度，9 mol/L以上的尿素適用于水稻葉片蛋白質的提取;硫脲是另一種增溶劑，在膜蛋白的提取中應用較多(Pasquali等1997)，但由于它不溶于水、溶于高濃度尿素的特性，需與尿素混合使用，硫脲使用濃度為2 mol/L;去垢劑也可有效地增加大多數蛋白質的溶解性，早期常用Triton X-100和NP-40等非離子去垢劑，近幾年改用CHAPS等新型兩性離子去垢劑;還原劑最常用的是二硫蘇糖醇(DTT)。專利《冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法》(專利號CN201310313597.0，公告號CN103333234A，公告日2013.10.2)中公開的含0-巰基乙醇的蛋白裂解液在植物蛋白提取中應用廣泛，但β-巰基乙醇是劇毒物質，對人體危害極大，并且該裂解液對質外體抗凍蛋白樣品的裂解不夠充分，使得蛋白質的損失較大;專利《一種蛋白標樣的制備方法及蛋白裂解液K專利號ZL201010197856.4，公告號CN101865796B，公告日2011.12.21)中公開了將標準蛋白樣品溶于含尿素的蛋白裂解液中，得到蛋白質標樣的方法，在該蛋白質標樣制備過程中使用含7?9M尿素的蛋白裂解液。但是上述專利中的蛋白裂解液不適用于冬油菜質外體抗凍蛋白的裂解，獲得的蛋白質含量較低，且蛋白圖譜不清晰。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種冬油菜葉片質外體抗凍蛋白標樣制備方法，能獲得較高含量的蛋白質，檢測到的蛋白條帶數多而清晰。
[0005]本發明的另一個目的是提供一種上述制備方法中所用的蛋白裂解液。
[0006]為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是:一種冬油菜葉片質外體抗凍蛋白標樣制備方法，將冬油菜葉片質外體抗凍蛋白干粉溶于含尿素的蛋白裂解液中保存，即得冬油菜葉片質外體抗凍蛋白標樣；
所述的冬油菜葉片質外體抗凍蛋白干粉是用質外體抗凍蛋白提取法從強冬性白菜型冬油菜油菜隴油7號和強冬性甘藍型冬油菜Vis1n中提取的。
[0007]本發明所采用的另一個技術方案是:一種上述制備方法中使用的蛋白裂解液，該蛋白裂解液中含有尿素，且尿素的摩爾體積濃度為6?I Omo I/L。
[0008]優選的，該蛋白裂解液含有以下組分:6?I Omo I / L尿素、O?3mo I / L硫脲、I %?4%(%表示質量百分數)CHAPS和30?70 mmol/L DTT。
[0009]進一步優選，該蛋白裂解液含有以下組分:6?lOmol/L尿素、1%?4%(%表示質量百分數)3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(CHAPS)和30?70 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)0
[0010]對上述冬油菜葉片質外體抗凍蛋白標樣進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，檢測到的蛋白條帶多而清晰。進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測時，冬油菜葉片質外體抗凍蛋白標樣的質量體積濃度為I.0?3.0lIgAiI;使用的I X SDS凝膠上樣緩沖液的體積為冬油菜葉片質外體抗凍蛋白和蛋白裂解液總體積的1/2。
[0011]該I X SDS凝膠上樣緩沖液中含有以下組分:50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、10mmoI/L DTT、2%(m/V)SDS、0.1%溴酚藍和 10%(V/V)甘油。
[0012]采用本發明蛋白裂解液比用含β-巰基乙醇的蛋白裂解液(按體積百分比由以下成分組成:12.5%摩爾體積濃度0.5 mol/L的Tris_HCL(pH6.8)、10%的甘油、5%的β-巰基乙醇和72.5%的(IdH2O)裂解得到的質外體抗凍蛋白樣品效果更佳，得到的蛋白含量高了 9?13倍，進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測到的蛋白條帶數多而清晰，毒性更小。本發明蛋白裂解液中不含有毒試劑巰基乙醇，可以減少對人體的危害。
【附圖說明】
[0013]圖1是對比例I和對比例2中蛋白干粉裂解后的裂解效果圖。
[0014]圖2是實施例1和實施例2中蛋白干粉裂解后的裂解效果圖。
[0015]圖3是實施例3和實施例4中蛋白干粉裂解后的裂解效果圖。
[0016]圖4是實施例5和實施例6中蛋白干粉裂解后的裂解效果圖。
[0017]圖5是對比例1、實施例1、實施例3和實施例5中蛋白干粉裂解后測得的蛋白含量直方圖。
[0018]圖6是對比例2、實施例2、實施例4和實施例6中蛋白干粉裂解后測得的蛋白含量直方圖。
[0019]圖7強冬性白菜型冬油菜隴油7號葉片中質外體抗凍蛋白SDS-PAGE凝膠電泳檢測圖。
[0020]圖8是強冬性甘藍型冬油菜Vis1n葉片中質外體抗凍蛋白SDS-PAGE凝膠電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0021 ]如無特殊指明，以下所采用的藥品和方法均為常規藥品和常規方法。
[0022]實驗驗證:
1.試驗材料
強冬性白菜型冬油菜:隴油7號(甘肅農業大學農學院油菜育種實驗室)和強冬性甘藍型冬油菜:Vis1n(歐洲)。
[0023]2.冬油菜的培養及低溫處理
I)選取籽粒飽滿的冬油菜種子放入鋪有兩層濾紙的13cm的培養皿中，注入蒸餾水1mL，種子露白后轉入裝滿營養土的9cm X 9cm的營養缽中，用蒸餾水澆灌，讓營養土充分吸水。
[0024]2)將試驗材料置于光照培養箱中，每天澆一次水，營養土澆透為宜。培養條件為:溫度設為恒溫25°C，每天光照14h，相對濕度為60?80%。
[0025]3)待葉片長至5?6片時，將試驗材料移至生化培養箱進行低溫處理，處理溫度為O°C，每天光照14h，處理一周。
[0026]3.質外體抗凍蛋白法提取冬油菜葉片中的質外體抗凍蛋白
1)采樣:采集經過低溫處理一周后的冬油菜葉片；
2)切條:用雙蒸水(ddH20)將葉片沖洗2遍，濾紙吸干表面水分后，將葉片切成I?2cm長條；
3)浸洗:用提取緩沖液(0.05M/LTris-HcU0.01M/L EDTA_Na2.2H20和0.02M/L VC)浸洗切成條的葉片2?3次；
4)抽真空:將切成條的油菜葉片放入帶塞的錐形瓶中，加入80?10ml上述提取緩沖液，抽真空，真空度穩定到0.07?0.08Mpa后，繼續抽真空7?1min;
5)離心:倒掉緩沖液，用濾紙吸去葉片表面溶液，放入注射器內，將注射器放入50ml離心管，在轉速為6100?6200rpm、3?5°C的條件下，離心14?16min，收集離心管底部液體，SP為非質體提取物；
6)在非質體提取物中加入5倍體積的冷丙酮，-20°C預冷，-20°C沉淀10?20h后，在轉速為10000rpm、4°C條件下，離心30min，傾去丙酮，沉淀在-20°C揮發丙酮，獲得蛋白干粉。
[0027]對比例I
取獲得的強冬性白菜型冬油菜隴油7號蛋白干粉，取含有以下組分:12.5% 0.5mol/LTr i s-HCL (pH6.8 )、10%甘油、5%β-巰基乙醇和7 2.5%雙蒸水(ddH20 )的含β-巰基乙醇的蛋白裂解液。按每毫克蛋白干粉中加入20μ I含β-巰基乙醇的蛋白裂解液的比例，將含β_巰基乙醇的蛋白裂解液加入獲得的蛋白干粉，室溫裂解2h，裂解期間每隔30min在渦旋器上震蕩，裂解2h后蛋白樣品呈粘稠狀如圖1中的A-1;然后在轉速10000rpm、4°C條件下離心15min，取上清液，在-20 °C保存備用。
[0028]對比例2
取獲得的強冬性甘藍型冬油菜Vis1n的蛋白干粉，取含有以下組分:12.5% 0.5mol/LTr i s-HCL (pH6.8 )、10%甘油、5%β-巰基乙醇和7 2.5%雙蒸水(ddH20 )的含β-巰基乙醇的蛋白裂解液。按每毫克蛋白干粉中加入20μ I含β-巰基乙醇的蛋白裂解液的比例，將含β_巰基乙醇的蛋白裂解液加入獲得的蛋白干粉，室溫裂解2h，裂解期間每隔30min在渦旋器上震蕩，裂解2h后蛋白樣品呈粘稠狀如圖1中的A-2 ；然后在轉速10000印111、4°(:條件下離心151^11，取上清液，在-20 °C保存備用。
[0029]實施例1
取獲得的強冬性白菜型冬油菜隴油7號蛋白干粉，取含有以下組分:6mol/L尿素、3%CHAPS和50 mmol/L DTT的蛋白裂解液。按每毫克蛋白干粉中加入20μ1該蛋白裂解液的比例，將該蛋白裂解液加入蛋白干粉中，室溫裂解2h，裂解期間每隔30min在渦旋器上震蕩，蛋白樣品呈澄清狀，如圖2中的B1-1，