一種基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒及使用方法。
【背景技術】
[0002] 絲狀支原體山羊亞種Mmc是致山羊和綿羊發生慢性呼吸道傳染疾病及影響養羊業 發展的重要疫病的主要病原菌之一，所致傳染性胸膜肺炎潛伏期平均為18~20d，最短的是3 ~6d，最長可達到30~40d。其臨床癥狀表現主要為體溫升高、萎靡呆立、食欲減退、呼吸困難 且痛苦呻吟。帶菌羊和病羊是該病的主要傳染源，該病主要是在接觸傳播和呼吸道，病死率 較高(Engin Balikci，2008;田青，2006)。1971年Carmicheal分離到具有致病性新型支原 體，且命名為絲狀支原體山羊亞種，相繼在許多國家如敘利亞、印度、蘇丹和肯尼亞等地發 現該病原。我國于在內蒙古曾經流行該病(Carmichael L E，1972;鄒聯斌，2007)。絲狀支 原體山羊亞種引發的早期支原體肺炎病例長時間以來未曾引起人們的重視，但近年調查發 現，該病死亡率呈不斷上升趨勢，給養羊業帶來嚴重的經濟損失(張雙翔，2013)。
[0003] 對絲狀支原體山羊亞種的防控，目前主要依靠藥物預防，也可使用疫苗，但防控成 本很高，究其原因與Mmc分離培養費時費力有關(候相山等，2006;趙萍等，2008)。臨床疫苗 應用后，目前缺乏疫病檢測與防控所需的快速血清學檢測手段，尤其可高通量檢測、敏感性 高的ELISA方法，缺乏有效的免疫防控效果評估，給養羊業帶來嚴重的經濟損失（張雙翔， 2012)。構建含Mmc LppA蛋白C末端基因的原核表達載體，建立基于表達產物Mmc LppA蛋白 的間接ELISA技術十分必要和緊迫。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題在于，選取核苷酸同源性較高的Mmc貴州分離株株，通 過Mmc LppA基因原核表達載體的構建與表達，建立基于表達產物Mmc LppA蛋白的間接 ELI SA方法，并進行條件優化，制備成商品化間接ELI SA試劑盒。該間接ELI SA試劑盒的發明， 將為Mmc引起的山羊間質性肺炎疫病的早期監測、免疫效果評價提供關鍵技術，對本病原所 致疫病的早發現早防控具有重要意義。
[0005] 本發明的技術方案為： 一種基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒，間接ELISA試劑盒的原料配方為:包被酶 標板卜5個，Mmc標準陽性血清0.5~1.5mL、Mmc標準陰性血清0.5~1.5mL、酶標二抗300-500μ 1^、50\?831'緩沖液2〇-2511^、底物液41〇11^-1511^、底物液81〇11^-1511^和終止液1〇11^-1511^。
[0006] 包被酶標板為重組蛋白包被，重組蛋白為Mmc LppA基因通過大腸桿菌Rosseta (DE3)表達系統獲得LppA重組蛋白，并通過鎳柱親和層析法獲得純化蛋白，使用包被緩沖液 稀釋為l.〇yg/l〇〇 yL ~3.0yg /100yL，室溫包被酶標板12h，3g/100mL的BSA溶液，37°C封閉 ELISA反應板1.5h后即為包被酶標板。
[0007] Mmc標準陽性血清應用絲狀支原體山羊亞種GZ-LD株免疫山羊獲得的高免血清，按 1:100稀釋。
[0008] Mmc標準陰性血清為采集自絲狀支原體山羊亞種血清抗體陰性的山羊血清，按1: 100稀釋。
[0009] 所述酶標二抗為兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀釋使用。
[0010]所述50XPBST緩沖液為：NaCl 400.0 g、KCl 10.0 g、KH2P04 10.0 g、Na2HP04 · 12H20 145 g、Tween-20 25 mL溶于400~500 mL蒸餾水，調整pH為7.2~7.6,定容至 1000 mL〇
[0011]所述底物液A為Na2HP04 14.60 g、檸檬酸9.33 g、過氧化氫脲0.52 g，溶于三蒸 水，并定容至1000 mL，調至p Η 5.0~5.4。
[0012] 所述底物液Β為TMB 20mg、無水乙醇8~10 mL，加雙蒸水至1 000 mL，過濾除菌，無 菌分裝。
[0013] 所述終止液為0.2 %~0.3% HF溶液。
[0014] -種基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒的使用方法，包含以下步驟： 第一，取包被酶標板，應用TOST洗滌ELISA反應板5次； 第二，將陰、陽性對照血清及待檢血清做1:100倍稀釋，按100yL加入酶標板反應孔中， 37°C孵育lh后，應用PBS洗滌ELISA酶標板各反應孔5次； 第三，將兔抗羊I gG-HRP用PBST做1:2000倍稀釋，按1 OOyL加入酶標板反應孔，37 °C作用 lh后，應用PBST洗滌酶標板反應孔5次； 第四，將底物液A和B各50yL加入ELISA反應板，避光室溫顯色10~15min，加入50yL終止 液，立即在酶標儀630nm波長下讀取0D值； 第五，試驗成立條件為陽性血清0D630平均值2 3.069，陰性血清0D630平均值< 1.741; 試驗結果判定標準為待檢樣本0D630值2 2.738為陽性，待檢樣本0D630值<2.738為陰性。 [0015 ]本發明有益效果:本發明方法適用于檢測羊Mmc感染抗體和免疫抗體，能夠體現機 體內Mmc感染水平或疫苗免疫效果，將為Mmc引起的山羊間質性肺炎疫病的早期監測、免疫 效果評價及后續研究工作提供關鍵技術，對本病原所致疫病的早發現早防控具有重要意 義，改變本病防控與監測缺乏商品化ELISA試劑盒的局面。本發明與現有技術相比，具有以 下的技術優勢和積極效果： (1)效果好:試劑盒能夠較好的體現機體Mmc感染水平或疫苗免疫水平;本試劑盒相對 于全菌蛋白包被，其敏感性、特異性更高，為Mmc引起的山羊和綿羊間質性肺炎的早期監測、 疫苗免疫效果評價具有重要意義。
[0016] (2)制備簡單、生產成本低:本試劑盒相對于全菌蛋白包被，解決了 Mmc培養困難、 培養周期長等問題，且保證了試劑盒批次間可重復性、一致性，重組蛋白的大批量生產、純 化成本低，周期短，提高了市場推廣可能。
[0017] (3)經濟、社會效益高:試劑盒的開發有效填補商品化試劑盒的缺失，且市場前景 廣闊，在內蒙古、新疆、貴州等山羊養殖區域具有廣泛應用前景，可簡化Mmc所致疫病程序， 提高疫苗免疫效果，試劑盒的生產應用將產生良好的經濟和社會效益。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明的Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒制備生產流程圖。
【具體實施方式】
[0019 ]本發明的實施例： 基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒原料及配方為： 酶標板；Mmc標準陽性和標準陰性血清；重組蛋白為Mmc LppA基因通過大腸桿菌 Rosseta(DE3)表達系統獲得LppA蛋白，并通過鎳柱法蛋白純化試劑盒進行重組蛋白純化， 純化目的蛋白經包被緩沖液稀釋為1.5yg /lOOyL;包被緩沖液：Na2⑶3 1.59g、NaHC03 2.93g溶于去離子水中，定容至lOOOmL，調至p Η 9.5~9.8;酶標二抗:兔抗羊以6-冊？；1\ PBST緩沖液：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH2P〇4〇.2g、Na2HP〇4*12H20 2.9g、Tween-20 0.5mL溶 于800mL蒸餾水，調整pH為7 · 2~7 · 6，定容至lOOOmL;封閉緩沖液：lg~5gBSA溶于lOmL PBST 緩沖液;底物液A:N