一種喹諾酮類藥物膠體金免疫層析檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫檢測領域，具體涉及一種喹諾酮類藥物的膠體金免疫層析檢測試紙條。
【背景技術】
[0002]喹諾酮類(Quinolones，QNs)藥物，又稱P比酮酸類或P比啶酮酸類，是一類較新的廣譜抗菌藥。在化學結構上，QNs屬于卩比酮酸衍生物(Pyridonecarboxylic acids,PCAs)0QNs作為一類全化學合成的抗菌藥物，具有抗菌活性強、抗菌譜廣、吸收快、體內分布廣泛等優點，價格與療效相當的抗生素相比較為低廉，已被廣泛應用于人和動物的多種感染性疾病治療中。國內動物產業對QNs類藥物的需求量極大，每年的用量在500噸以上，并且市場需求量仍處于快速增長階段。由于近年來環境惡化，水產養殖動物病害頻發，致使QNs藥物過度使用現象嚴重，水產品中QNs藥物殘留超標已對水產養殖業造成了極大的負面影響。
[0003]目前，對水產品中QNs殘留的檢測方法包括微生物法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、毛細管電泳分析法、免疫分析法等。HPLC和LC-MS作為實驗室檢測QNs的常規方法具有高準確性、高精確性和高靈敏度，但需要繁瑣的樣品處理步驟、昂貴的儀器以及專業的操作技能，因此不適宜用來檢測大批樣品及推廣使用。
[0004]膠體金免疫層析技術由于其快速、便捷，不需特殊設備，結果判斷直觀等優勢，越來越受到人們的重視。本發明利用單克隆抗體和膠體金標記技術建立喹諾酮類膠體金免疫層析快速檢測方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于公開一種喹諾酮類藥物的膠體金免疫層析檢測試紙條，具體為一種快速檢測11種喹諾酮類藥物(環丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星、甲磺酸達氟沙星、鹽酸二氟沙星、鹽酸沙拉沙星、伊諾沙星和司帕沙星等)膠體金免疫層析試紙條，并提供該試紙條的制備方法，具有特異、準確、快速、操作簡單、高通量檢測的優勢。應用該試紙條檢測喹諾酮類藥物全過程不超過15 min。
[0006]本發明一種喹諾酮類藥物的膠體金免疫層析檢測試紙條，該試紙條包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、底板;樣品墊的材料選自玻璃纖維、濾紙纖維或聚脂膜，金標墊的金標抗體支持膜選自玻璃纖維、濾紙纖維或聚脂膜，吸收墊選用吸水濾紙，底板選用帶不干膠的PVC板。底板上以樣品墊為起始端，依次重疊粘貼固定有樣品墊、金標墊、帶有檢測線和質控線抗體的硝酸纖維素膜、吸收墊。抗環丙沙星的抗體為單克隆抗體;質控線抗體根據金標抗體的來源可選擇羊抗鼠、兔抗鼠的IgG或葡萄球菌A蛋白。
[0007]具體是由包被了抗環丙沙星單克隆抗體膠體金標記物的金標墊、包被了環丙沙星牛血清白蛋白人工完全抗原(CPFX-BSA)和兔抗鼠IgG或葡萄球菌A蛋白或葡萄球菌G蛋白的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水紙、底板等組成，底板上以樣品墊為起始端，依次重疊粘貼固定有樣品墊、金標墊、帶有檢測線和質控線抗體的硝酸纖維素膜、吸水紙。
[0008]為了實現上述目的，本發明所采取的技術方案如下:
該試紙條的制備步驟包括:(1)制備抗環丙沙星單克隆抗體;(2)制備納米膠體金顆粒；(3)制備抗環丙沙星單克隆抗體的納米膠體金標記物，形成金標抗體；(4)將金標抗體均勻噴涂到金標抗體支持膜上，經干燥制備金標墊；(5)將抗環丙沙星單克隆抗體噴涂到硝酸纖維素膜上的檢測線位置作為檢測線捕獲抗體，抗金標抗體的二抗或葡萄球菌A蛋白噴涂到硝酸纖維素膜上的質控線位置作為質控線捕獲抗體，并封閉硝酸纖維素膜上的空白位點；(6)將吸收墊、帶有檢測線和質控線抗體的硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、底板組裝成膠體金免疫層析檢測試紙條。
[0009]具體包括如下:
(1)抗環丙沙星單克隆抗體的制備:通過CPFX-BSA抗原免疫Balb/c小鼠，制備脾細胞懸液、骨髓瘤細胞懸液;將脾細胞與骨髓瘤細胞經過細胞雜交融合，篩選陽性單克隆細胞孔；經進一步的陽性克隆化及其篩選，建立抗環丙沙星菌陽性、特異性好的細胞株I株，命名為5G4。取雜交瘤細胞株5G4在培養后腹腔注射Balb/c小鼠制備腹水，并經過純化獲得抗環丙沙星單克隆抗體5G4;
(2)納米膠體金的制備:將100mL 0.01%氯金酸用I mL I %檸檬酸三鈉制備納米膠體金顆粒溶液；
(3)抗環丙沙星單克隆抗體5G4的膠體金標記物制備:用0.1mol.L K2CO3將上述膠體金溶液的PH值調至8.5，將納米膠體金顆粒溶液與抗環丙沙星單克隆抗體5G4按10mL膠體金溶液加入0.2mg單克隆抗體的比例混合均勾，并使膠體金與抗體形成穩定的膠體金復合物，在通過純化、濃縮后形成膠體金標記物；
(4)將抗環丙沙星單克隆抗體5G4膠體金標記物噴涂在金標墊上，將CPFX-BSA抗原和兔抗鼠IgG噴涂在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線位置上，在37°C干燥箱烘干；
(5)將噴涂有檢測線與質控線抗體的硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水紙等依次粘在底板上；
(6)將依次粘好的底板材料切成裁切成寬X長為0.35cmX6cm的長條即為喹諾酮類藥物膠體金免疫層析檢測試紙條，包裝備用。
[0010]所述試紙條應用于檢測環丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星、甲磺酸達氟沙星、鹽酸二氟沙星、鹽酸沙拉沙星、伊諾沙星和司帕沙星等11種喹諾酮類藥物。該檢測步驟如下:(I)取80-150 yL待檢樣本加在檢測試紙條的加樣區；(2)在20 min內觀察檢測結果。
[0011]本發明的積極效果在于:
(1)低價格:產品生產流程簡單，生產成本低；
(2)檢測速度快:全過程15min內完成；
(3)可以生產現場檢測、高通量檢測；
(4)高質量:本方法制備而成的試紙條特異性好、靈敏度高、重復性好；
(5)操作簡單:本方法制備而成的試紙條以膠體金作為指示標記，快速定性，結果準確、快速，操作簡便，只需要加樣檢測與結果記錄步驟；
(6)易于推廣使用:操作人員無需專業培訓，按說明書即可完成操作。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明一種快速檢測喹諾酮類藥物膠體金免疫層析試紙條的組裝結構圖，其中:I是樣品墊;2是金標墊;3是檢測線顯色位置;4是質控線顯色位置;5是硝酸纖維素膜；6是吸水紙;7是底板。
[0013]圖2為本發明一種快速檢測喹諾酮類藥物膠體金免疫層析試紙條的外觀結構圖，其中:8是塑料外殼;9是結果讀取窗口 ； 10是檢測樣品加樣區。
【具體實施方式】
[0014]本發明的【具體實施方式】參照下面的實施例進行詳細說明，但并不局限于此。
[0015]實施例1、抗環丙沙星單克隆抗體的制備
用CPFX-BSA完全抗原免疫Balb/c小鼠，制備脾細胞懸液和骨髓瘤細胞懸液;將脾細胞與骨髓瘤細胞經過細胞雜交融合，篩選陽性單克隆細胞孔;建立抗環丙沙星單克隆抗體細胞株5G4，小鼠腹腔注射制備腹水，并純化抗環丙沙星單克隆抗體。
[0016]實施例2、膠體金顆粒的制備
取250 mL三角瓶一個，制備lwt%氯化金100 mL，加熱沸騰;取I mL的1的%梓檬酸鈉加入上述溶液中，迅速混合均勻，再保持沸騰15 min，自然冷卻后蒸餾水恢復至100 mL體積;膠體金溶液用硅化過的試劑瓶分裝4 °C保存，備用。
[0017]實施例3、金標墊的制備
取兩個50 mL的試管，分別加入10 mL 25 nm膠體金;加入適量0.05 moL.L—1 K2CO3調整PH為8.5;4°C條件下，加入最佳標記濃度的抗環丙沙星單克隆抗體5G4反應20 min，將膠體金溶液與抗環丙沙星單克隆抗體5G4按10mL膠體金溶液加入0.2mg單克隆抗體的比例混合均勻，4 0C 12000 r.min—1離心30 min，棄去上清;每支離心管中加入10 mL重懸液懸浮