高穩定性的表面增強拉曼光譜的液相檢測裝置及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于激光共聚焦拉曼光譜檢測領域，具體來說，涉及一種高穩定性的表面增強拉曼光譜的液相檢測裝置及檢測方法。
【背景技術】
[0002]拉曼光譜是一種散射光譜。光照射到物質上發生彈性散射和非彈性散射，彈性散射的散射光是與激發光波長相同，非彈性散射的散射光有比激發光波長長的或短的成分，統稱為拉曼效應。拉曼效應起源于分子振動與轉動，因此拉曼光譜能夠提供分子內部各種簡正振動頻率及其振動能級情況，從而鑒定分子中存在的官能團、分子特征結構及其所處的環境。利用拉曼光譜技術對樣品進行檢測和鑒別具有非接觸、無破壞等優點，無需特殊樣品制備步驟，并且由于水對拉曼光譜的影響非常小，所以拉曼光譜可以被廣泛地應用于生物體系中具備生物活性樣品的檢測。然而拉曼散射光譜的強度僅為入射光強的10—1()，信號太弱以致難以收集檢測。近年來，隨著納米技術的不斷發展，表面增強拉曼散射光譜技術(Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)的出現極大的提高了拉曼光譜技術的檢測靈敏度。當具有拉曼活性的分子與金屬納米結構接觸時，通過金屬納米結構的電磁增強和化學增強效應作用，能夠使分子的拉曼光譜得到極大增強，增強能力達14?107。因此，基于SERS的拉曼檢測技術在超靈敏檢測中已有廣泛應用。
[0003]但是長久以來，基于SERS的拉曼檢測技術只能夠對樣品進行定性的分析，極大地限制其在定量分析領域中的應用，造成這一結果最為關鍵一點就是缺少簡單易行的手段將納米結構排列成均勻的SERS基底，從而在不同的基底區域獲得均勻一致可重復的SERS信號。通過離子束或電子束光刻技術能夠獲得大范圍均勻的金屬納米結構陣列，用作可重復的SERS基底，但該方法需要大型設備，花費大產出低。較常用的方法就是將金屬納米顆粒與拉曼活性分子的混合溶液滴在硅片上，等液滴干燥后直接對硅片表面混合物質檢測，由于干燥過程中“咖啡環”效應而導致干燥后的液滴區域內物質分布不均，液滴邊緣濃度大，而中間區域稀少，從而導致SERS信號嚴重不均勻，同一個基片上不同點測得的拉曼信號強度千差萬別無法重復，雖然方法簡單，但只能用于定性分析。此外，靜電吸附組裝方法制備SERS基底也得到廣泛應用。通過靜電吸附作用，可以將帶電金屬納米顆粒均勻鋪散在硅片表面得到均一 SERS基底，但由于顆粒結構和尺寸不同導致沉降速率不一樣，在硅片表面通過靜電吸附形成的顆粒陣列密度不同，因此也無法定量評價不同金屬納米顆粒之間的SERS活性的相對高低。傳統表面增強拉曼光譜檢測方法耗時、耗力且效果不佳這些問題，無法滿足樣品的簡單、快速、準確定量分析要求。因此本團隊將注意力從固相加測轉移到液相檢測中來，因為固相檢測的不確定性就是由于分子濃度或者增加結構不均勻導致，而在溶液中金屬納米顆粒和拉曼分子都是均勻分布的，且很多生物活性物質在溶液中才能保證其活性不變，因此液相拉曼檢測對于很多物質的分析和鑒別具有重要意義。然而，目前用市面上常用的耦合正置激光共聚焦顯微鏡的拉曼光譜儀來檢測溶液樣品，所得到的拉曼光譜強度也是忽高忽低，很不精確。在實驗過程中我們發現，造成這一現象的原因主要是激光聚焦點選取不當:當選取溶液表面或者溶液與容器底部接觸面作為聚焦點，因納米顆粒會在液體表面形成膜狀漂浮團聚體，在容器底部也會不可避免的存在一些團聚體受重力作用沉降下來，從而造成聚焦點測得拉曼光譜局部增強，而在其他地方強度較低；當選擇溶液中心作為聚焦點，在檢測過程中大家都忽視了檢測光程對結果造成的影響，激光在檢測溶液中光程不同，進而光程內被激發的拉曼分子數量不同，最終導致拉曼信號強度不穩定。
【發明內容】
[0004]技術問題:本發明所要解決的技術問題是:提供一種高穩定性的表面增強拉曼光譜的液相檢測裝置，該檢測裝置可以定量的檢測溶液樣品的表面增強拉曼光譜，且拉曼光譜具有穩定性，滿足樣品無損、無需預處理、快速準確等檢測需求；同時還提供檢測方法，簡單易操作，且檢測準確。
[0005]技術方案:為解決上述技術問題，本發明實施例采用的技術方案是:
一方面，本實施例提供一種高穩定性的表面增強拉曼光譜的液相檢測裝置，該檢測裝置包括帶有物鏡的倒置激光共聚焦顯微鏡、拉曼光譜儀、用于盛放待測溶液的容器、聚焦基片和隔片，隔片中設有通孔；隔片置于容器中，聚焦基片位于隔片上方，且聚焦基片覆蓋隔片的通孔;待測溶液完全浸沒聚焦基片和隔片通孔;容器位于激光共聚焦顯微鏡的樣品臺上，物鏡位于激光共聚焦顯微鏡的樣品臺下方;物鏡鏡頭與隔片的通孔相對;拉曼光譜儀的光路與激光共聚焦顯微鏡的物鏡的光路連接。
[0006]作為優選例，所述的容器為透明光學石英材質制成。
[0007]作為優選例，所述的聚焦基片為石英片或者硅片，且石英片的光滑面或者硅片的光滑面與隔片相對。
[0008]作為優選例，所述的隔片和聚焦基片完全浸沒在待測溶液液面下方。
[0009]另一方面，本實施例提供一種高穩定性的表面增強拉曼光譜的液相檢測方法，該檢測方法包括:
第一步:連接檢測裝置:將隔片置于容器內側底面上，然后將聚焦基片置于隔片上，且聚焦基片覆蓋隔片的通孔;將激光共聚焦顯微鏡倒置;將容器置于激光共聚焦顯微鏡的樣品臺上，調整激光共聚焦顯微鏡的樣品臺，使容器位置正對位于激光共聚焦顯微鏡樣品臺下方的物鏡，且物鏡鏡頭與隔片的通孔相對;將拉曼光譜儀的光路與激光共聚焦顯微鏡的物鏡的光路連接；
第二步:將待測溶液倒入容器中，待測溶液完全浸沒聚焦基片和隔片的通孔，且待測溶液的液面位于聚焦基片上方；
第三步:開啟激光共聚焦顯微鏡和拉曼光譜儀，拉曼光譜儀的激發光束通過共聚焦顯微鏡的物鏡聚焦為光斑，調節聚焦平面將光斑映射在聚焦基片和待測溶液交界面處，激光光束和光斑所在范圍內，激發出的拉曼散射信號通過激光共聚焦顯微鏡的物鏡接收并傳送到拉曼光譜儀中，拉曼光譜儀采集拉曼散射信號并繪制出拉曼光譜。
[0010]作為優選例，通過調節隔片的厚度對檢測光程進行精確調節，檢測光程為拉曼光譜儀發出的激光光束和光斑在待測溶液中所占范圍。
[0011]有益效果:與現有技術相比，本發明實施例具有以下有益效果:
1.本發明實施例的液相檢測裝置及方法，無需將金屬納米顆粒利用各種費時費力的方法排列成均勻的陣列或單層膜，直接對溶液中顆粒和拉曼分子進行檢測，無需特殊處理制樣簡單快速，由于顆粒和拉曼分子在溶液中自由分散、密度均勻，排除了顆粒不規則團聚的耦合作用對檢測造成的誤差，極大的提高了所測拉曼光譜的重復性。
[0012]2.本發明實施例的檢測裝置及方法，選取溶液中間界面(如圖1中的P3 )作為激光光斑聚焦點，而非使用傳統液相檢測方法中選取的溶液上液面(如圖1中的Pl)或者溶液與容器底接觸面(如圖1中的P2)作為聚焦點。在溶液上液面(如圖1中的Pl)納米顆粒會由于自組裝作用形成微小的膜碎片漂浮在溶液上表面。容器底部接觸面(如圖1中的P2)因為沉降作用而積累了不均勻分散的納米顆粒微小團簇。因此將激光光斑聚焦在溶液上液面或者容器底接觸面這兩個界面，獲得的拉曼光譜穩定重復性非常差，不均勻分散的顆粒團聚體或組裝體導致拉曼光譜強度忽高忽低。本實施例選取溶液中間界面作為激光聚焦點，有效避開團聚體和組裝體，通過檢測均勻分散的顆粒和拉曼分子復合物獲得穩定的拉曼光譜。
[0013]3.本發明實施例的檢測裝置及方法中，隔片的厚度可調，從而調節激光在液體中的光程，通過使用不同厚度的隔片，所測得的拉曼光譜強度隨著光程增加而線性增加。這是因為光程增加導致所被激發的顆粒和拉曼分子數量增加，從而獲得了更強的拉曼散射信號。而傳統液相拉曼檢測方法是使用拉曼光譜儀結合正置激光共聚焦顯微系統，對石英片上微小液滴或者石英毛細管中溶液進行測量，沒有考慮到檢測方法中光程對檢測結果的影響，而且在這些方法中很難保證不同樣品在檢測時光程一致，導致檢測中產生誤差。考慮到光程能夠極大影響所測得拉曼光譜的強度，本實施例的檢測方法可以非常簡單地通過調節隔片的厚度來調節和固定光程，有效排除傳統方法中光程不確定對結果的誤差，獲得更加準確的拉曼光譜。
【附圖說明】
[0014]圖1為本